Простой метод выделения нуклеиновых кислот в полевых условиях

Острой проблемой современного здравоохранения является диагностика инфекционных заболеваний в малообеспеченных регионах и поселениях, удаленных от хорошо оснащенных лабораторных центров. Решением проблемы могут стать диагностические тесты у постели больного. Анализ нуклеиновых кислот (nucleic acid testing, NAT) считается одним из самых надежных методов выявления патогенов в биологических образцах. В основе работы тест-систем у постели больного, основанных на NAT, лежат три аспекта: 1) подготовка образца, то есть выделение и очистка нуклеиновых кислот; 2) амплификация; 3) регистрация и интерпретация полученного сигнала. При этом система должна удовлетворять ряду требований, среди которых высокая скорость работы, простота в транспортировке и хранении, низкая стоимость и т. д.

В настоящее время разработчики занимаются упрощением второго и третьего шагов, то есть амплификации и регистрации сигнала, и приспосабливают приборы для работы с сырыми биологическими образцами. Однако такой подход ведет к удорожанию и снижению чувствительности системы. Группа корейских ученых пошла по другому пути и описала в Scientific Reports способ упрощения и удешевления первого шага — пробоподготовки.

В основе метода лежат обычный шприц и фильтр-насадка к нему. Авторы модифицировали коммерческие тефлоновые шприцевые фильтры с размером пор 1 мкм: на тефлоновую поверхность нанесли амин-функционализированный диатомит (amine-functionalized diatomaceous earth, ADE) и гомобифункциональные имидоэфиры (homobifunctional imidoesters, HIs). Образец набирается в шприц и пропускается через фильтр. HIs взаимодействуют с аминогруппами ADE и формируют связи с высоким положительным зарядом. Эти связи притягивают отрицательно заряженные клетки патогенов из образца. Клетки накапливаются на фильтре. Затем фильтр обрабатывается лизирующим раствором для высвобождения нуклеиновых кислот. HIs обладают перекрестносшивающей активностью: через аминогруппы они сшивают ADE с нуклеиновыми кислотами при определенных значениях pH. При смене pH связи разрушаются. Поэтому после лизирующего агента фильтр промывают буфером с pH 8 (нуклеиновые кислоты связываются), а затем обрабатывают буфером с pH 10, и чистые нуклеиновые кислоты переходят в раствор.

Метод проверили на суспензиях патогенов Brucella ovis, Salmonella enterica и Aspergillus fumigatus в фосфатном буфере, а также в человеческой моче и в сыворотке крови. Адсорбцию микробов на фильтре проверяли микроскопически, с окрашиванием флуоресцентным красителем DAPI. Выход и качество РНК и ДНК определяли с помощью количественной ПЦР в реальном времени и традиционной ПЦР, соответственно.

Фильтры захватывали 98,3% клеток патогенов при минимальной рабочей концентрации клеток 1 КОЕ/мл. Для бактериальных клеток выход нуклеиновых кислот был сопоставим с выходом для коммерческих наборов для выделения ДНК и РНК. Для работы с Aspergillus fumigatus метод не подошел из-за прочной клеточной стенки грибка. Для функционализации аминных групп в диатомите использовали 3-аминопропилдиэтоксисилан. Наиболее подходящим HI оказался диметил суберимидат.

Новая система пробоподготовки не требует центрифуги, термостата или другого сложного оборудования, чистых комнат и даже электричества, нужны только человеческие руки. Подход, основанный на шприцевых фильтрах, дает возможность работать с большими (до 50 мл) объемами образца. Все компоненты системы дешевы и стабильны, что позволяет легко транспортировать ее к месту анализа. Авторы отмечают, что связывание с ADE стабилизирует РНК: она не деградирует в течение как минимум 20 минут — ровно столько занимает полный цикл пробоподготовки. Полученный раствор нуклеиновых кислот можно замораживать и хранить до анализа. Метод также можно адаптировать для 96-луночных фильтровальных планшетов.

Авторы считают, что разработанный ими подход имеет большие перспективы для применения в диагностике у постели больного.