Перепрограммирование Т-клеток редакторами оснований безопаснее традиционного CRISPR/Cas9

Одним из наиболее перспективных методов лечения рака является адоптивная иммунотерапия, при которой пациенту подсаживают модифицированные лимфоциты, экспрессирующие рецепторы к опухолевым антигенам — искусственные химерные антигенные рецепторы CAR (chimeric antigen receptors). CAR-T-лимфоциты узнают раковые клетки и способствуют их уничтожению. Используют как лимфоциты самого пациента, так и донорские. Второй вариант более эффективный, однако аллогенные Т-клетки могут вызвать реакцию «трансплантат против хозяина» или отторжение иммунной системой. Поэтому производство высокофункциональных CAR-T-клеток связано с мультиплексным генным редактированием.

T-клетки модифицируют, в частности, с помощью системы CRISPR/Cas9, которая имеет высокую эффективность перепрограммирования, но при этом может иметь генотоксический эффект из-за множественных двухцепочечных разрывов или индуцировать хромосомные перестройки.

Метод редактирования оснований (base editing) разработан на базе. Комплекс каталитически неактивного белка dCas9 с гидовой РНК (гидРНК) доставляет пришитый к dCas9 фермент цитидин дезаминазу к определенной последовательности в ДНК. dCas9 не способен разрезать ДНК, он лишь связывается с ней, а дезаминаза снимает аминогруппу с цитозина, превращая его в урацил. Дальше клеточная система репарации неспаренных оснований в паре U:G заменяет гуанин на аденин, то есть образуется пара U:A, которая после раунда репликации превращается в T:A.

Авторы новой статьи, опубликованной в Nature Communications, показали, что редактирование оснований является более эффективным подходом для получения CAR-T-клеток, чем использование CRISPR/Cas9, поскольку обеспечивает нарушение работы генов без возникновения двухцепочечных разрывов и транслокаций в молекуле ДНК. Ученые использовали редакторы оснований для устранения продуктов генов, специфичных для T-клеток донора и способных вызвать иммунный ответ у реципиента.

Гидовая РНК и мРНК редакторов оснований (dCas9 с разными вариантами дезаминазы) доставлялись в Т-клетки методом электропорации. В качестве мишеней были выбраны гены TRAC, PDCD1 и B2M, кодирующие константный домен Т-клеточного рецептора, PD-1 и β-2 микроглобулин, соответственно. Замена C:G на T:A приводила к образованию преждевременных стоп-кодонов или разрушению донорных либо акцепторных сайтов сплайсинга и, следовательно, нокауту генов. Ученые обнаружили, что использование редакторов оснований приводит к снижению концентрации белков — продуктов генов-мишеней на 90%. Кроме того, используя секвенирование по Сенгеру и программу EditR, разработанную для быстрого анализа результатов редактирования, авторы показали, что редакторы оснований, в отличие от, приводит к минимальному образованию двухцепочечных разрывов. Исследователи также продемонстрировали, что редактирование оснований практически исключает события транслокации, тогда как частота транслокаций для CRISPR/Cas9 может превышать 2%.