Для целевого редактирования РНК нужна всего одна молекула

Последнее время активно развиваются не только технологии редактирования ДНК, но и РНК. Для этого, в частности, можно использовать фермент ADAR — в двухцепочечной РНК он дезаминирует аденозин с образованием инозина, который при трансляции ведет себя как гуанин. Специфичность же достигается присоединением деаминазы к dCas13 с гидРНК (dCas13, в отличие от других CRISPR-ассоциированных белков, не разрезает цепочку нуклеиновой кислоты) или к другим белкам. Именно так устроены системы редактирования РНК, разработанные группой Фэна Чжана в Институте Брода: REPAIR (замена A на I) и недавно предложенная RESCUE (замена C на U, причем используется фермент ADAR2, превращенный с помощью направленного мутагенеза в цитидиндеаминазу). Однако необходимость экспрессировать в клетке и фермент, и гидРНК влечет за собой ряд ограничений и нежелательных эффектов.

Оказалось, что введения в клетку только гидРНК достаточно для редактирования транскрипта, поскольку их двухцепочечный комплекс активирует эндогенный ADAR. (В естественных условиях эти ферменты, редактирующие РНК, участвуют в регуляции трансляции.) Такая гидРНК в новой системе LEAPER получила название ADAR-привлекающая РНК (апРНК). Вводить в клетку ее можно как синтетический олигонуклеотид либо в виде кодирующей последовательности в плазмиде или вирусном векторе. Эффективность редактирования сильно зависит от длины апРНК и окружения редактируемого нуклеотида — последнее было успешно использовано для устранения нецелевого редактирования. Максимальная эффективность достигала 80%, впрочем, в большинстве экспериментов она не превышала 50%.

Технология LEAPER успешно работает в разных клеточных линиях, а коэкспрессия различных апРНК позволяет редактировать несколько сайтов одновременно. При этом введение апРНК не вызывает РНК-интерференцию и иммунный ответ, не влияет на нормальное функционирование ADAR и не приводит к редактированию нецелевых транскриптов.

Ученые проверили систему на клинически важной мутации в гене-супрессоре опухолей TP53, который экспрессирует p53. Экспрессия полноценного p53 была восстановлена.

Наконец, LEAPER применили для лечения моногенетического заболевания — синдрома Гурлер, наиболее распространенного подтипа мукополисахаридозов типа I. Болезнь вызвана мутацией в гене IDUA, из-за которой белок IDUA (альфа-L-идуронидаза) неактивен. Введение апРНК в фибробласты пациента частично восстановило активность белка (эффективность редактирования составила 30%). Чтобы понять, насколько это повлияло на болезнь, ученые сравнили восстановленную активность с таковой при синдроме Шейе — более мягком типе мукополисахаридоза, при котором альфа-L-идуронидаза малоактивна. Активность в редактированных клетках была примерно в полтора раза больше, что указывает на терапевтический потенциал LEAPER.

Эффективность и специфичность системы можно совершенствовать и дальше, но уже сейчас она имеет ряд важных преимуществ: небольшой размер апРНК, примерно такой же, как при РНК-интерференции, однако здесь речь идет о целевом редактировании, а не о деградации всей РНК. Использование же эндогенного ADAR не только упрощает систему, но и снижает неспецифичность, вероятность возникновения иммунного ответа и онкогенность.