Плоды освещения

На сайте Kickstarter недавно завершился сбор средств на создание первого «детища системной биологии» — светящегося растения Arabidopsis thaliana. Энтузиасты пожертвовали почти полмиллиона долларов трем молодым людям, которых пресса уже прозвала «биохакерами» — в том числе и потому, что их работа не подпадает под юрисдикцию FDA и других госорганов, которые обычно занимаются регуляцией ГМО в США.

«В труднодоступных высокогорьях Панамы, в бассейнах, охраняемых сторожевыми собаками, окруженная сетками и колючей проволокой, плавает самая дорогая и изученная рыба в мире». Так начинается текст Nature о лососе с эндогенной продукцией гормона роста, который уже 18 лет пытается вывести на рынок компания AquaBounty. В следующем году, пока быстрорастущий лосось, скорее всего, так и будет плавать в панамском бассейне, ожидая очередного одобрения от госорганов США, частные энтузиасты без всякой бюрократии получат семена первого «детища системной биологии» — светящегося растения Arabidopsis thaliana.

Никакого контроля за распространением «живой лампочки» не подразумевается: по уверениям авторов проекта, правительство США не имеет полномочий контролировать создание таких организмов, если они не предназначены для употребления в пищу (и это притом, что ДНК растения будет оснащена не одним, а целой батареей рекомбинантных генов). Вложившиеся в проект энтузиасты смогут свободно выращивать светящиеся растения, собирать их семена и даже (возможно) получать новые светящиеся гибриды.

Фермент Люцифера

В популярной прессе светящимися называют организмы, обладающие и флюоресценцией, и люминесценцией. Оба процесса встречаются в природе (порой у одних и тех же организмов) и оба используются в качестве исследовательских инструментов. Но если флюоресценция предполагает пассивное переизлучение света с небольшим уменьшением энергии и соответствующим сдвигом в длине волны, то люминесценция — это активный процесс, в ходе которого химическая энергия преобразуется в свет.

Ферменты, которые проводят преобразование химической энергии в свет, называются люциферазами, а их субстраты — люциферинами (оба слова происходят от латинского lucifer — «несущий свет»). Несмотря на одинаковое название, между люциферазами и люциферинами, скажем, жуков-светляков и бактерий, помимо собственно функции, очень мало общего: они имеют разное строение, разное происхождение и по-разному работают.

Наиболее известной является система свечения жуков-светляков. В ходе реакции, которую катализирует люцифераза, молекула АТФ, универсальная единица клеточной энергии, активирует люциферин, после чего к нему присоединяется кислород (интересно, что у всех организмов, несмотря на независимое возникновение системы свечения, оно так или иначе связано с окислением). «Магия» происходит в тот момент, когда от окисленного люциферина отделяется CO₂: молекула красителя оказывается в возбужденном состоянии, покидая которое она испускает квант света.

Свет, производимый люциферазой, может иметь почти любой оттенок — от сине-зеленого до красного. Здесь, однако, есть интересная тонкость: у многих кишечнополостных (кораллов, медуз и их родственников) в клетках встречаются одновременно и люцифераза, и флюоресцирующие белки (например, небезызвестный GFP). Причем обычно они не просто находятся в одной клетке, но и настолько тесно связаны друг с другом, что возникает квантовый эффект переноса возбуждения: фотон, произведенный люциферазой, не излучаясь, переносится на GFP, который его выбрасывает уже с измененной длиной волны. Поэтому такие беспозвоночные, как Renilla reniformis, светятся не синеватым, а зеленым. Использование GFP позволяет увеличить эффективность излучения за счет того, что флюоресцентный белок по сравнению с люциферином таких организмов менее склонен терять возбужденное состояние без излучения кванта света. У жуков-светляков, равно как и у люминесцентных бактерий, нет белков, подобных GFP, и в этом отношении их система свечения устроена проще.

Потенциал биолюминесценции для исследований ученые распознали сразу же, как только стал известен ее механизм. После появления технологии рекомбинантных ДНК последовательность люциферазы стали «пришивать» к любым интересным генам и следить за тем, как их активация сопровождается свечением. Фармкомпании взяли на вооружение люциферазу взамен обычного красителя в лабораторных тест-системах: она, в отличие от красителей, позволяет полностью избавиться от постороннего «шума». Исследования биолюминесценции, в основном в связи с различными практическими методами ее использования, превратились в целую отрасль биотехнологии со своими журналами, обществами, конференциями и другими атрибутами.

Тем не менее с точки зрения биотехнологии эта система не лишена недостатков. Во-первых, после окисления и испускания кванта света отработанный люциферин уже непригоден для реакции и его требуется регенерировать. Помимо прочего, такой люциферин сам по себе ингибирует работу фермента. Для лабораторных тест-систем этот недостаток не имеет особого значения: в плашку можно просто добавить побольше субстрата. Но если речь идет о создании отдельных светящихся организмов, то регенерация люциферина становится настоящей проблемой.

Во-вторых, если люцифераза светлячков кодируется всего одним геном и его относительно просто внести в геном, то люциферин — это органическая молекула. Чтобы ее синтезировать, в геном нужно вставлять целую батарею генов, которые собирают люциферин из кусочков. Достигнуть этой цели ученым удалось только недавно.

Первые «условно светящиеся» растения, полученные (.pdf) группой Стивена Хоувелла в 1986 году (морковка и табак), содержали только саму люциферазу и сами по себе света не излучали — их надо было опрыскивать люциферином или добавлять его в почву. Это, кстати, можно заметить и на фотографиях, которые впоследствии стали символом проекта Glowing Plant — на них у табака сильнее всего светятся корни и сосуды, но не потому, что там лучше работает люцифераза, а потому, что по ним из почвы движется субстрат.

Первое растение, способное светиться само по себе, было получено гораздо позже — лишь в 2010 году. Над ним работали Александр Кричевский и его коллеги из университетов Нью-Йорка и Израиля. Для того чтобы заставить табак производить собственный люциферин, ученые использовали блок генов из люминесцирующих бактерий Photobacterium leiognathi. При этом гены встроили в геном хлоропластов — таким образом, чтобы они не могли распространяться с пыльцой.

Однако трансгенный табак светился очень слабо — его свет едва виден на фотографиях с очень длинной выдержкой. Это объясняется, как мы уже знаем, проблемой регенерации люциферина, а также тем, что гены не всегда эффективно работают при переносе из одного организма в другой. В целом для исследования растений такая генетическая система вполне подходила (Кричевский даже зарегистрировал соответствующий патент), но о других применениях никто, по-видимому, до последнего времени не задумывался.

Post Tenebras Lux

Ученые всегда рассматривали конструкции с люциферазой исключительно как маркеры, способные подсветить интересующие их клетки или помочь измерить активность исследуемых генов. Сама же мысль о том, что подобные рабочие инструменты можно использовать для чего-то совершенно с исследованиями не связанного, появилась у группы студентов, участвовавших в конкурсе iGEM, который вот уже несколько лет организует Массачусетский технологический институт. В рамках этого конкурса молодые ученые из разных стран собираются в команды, придумывают и реализуют небольшие проекты, которые так или иначе могут быть отнесены к области синтетической биологии.

iGEM во многом напоминает конкурсы молодых программистов — команды работают над новыми, необязательно связанными с практикой задачами, а результатом этой работы, по замыслу организаторов, должны быть не какие-то глобальные проекты, а отдельные самостоятельные «методические кирпичики», которые можно будет так или иначе использовать в синтетической биологии. Все проекты конкурса направлены на пополнение так называемого Стандартного перечня биологических расходных частей. Предполагается, что этот перечень станет со временем чем-то вроде репозитория программ, который уже много лет используют энтузиасты открытого исходного кода. На iGEM были придуманы среди прочего биосенсор мышьяка, генетическая система, заставляющая бактерии производить пигменты разного цвета в зависимости от концентрации тестового вещества, и даже штамм микроорганизмов, который может использоваться (пока только теоретически) в качестве кровезаменителя.

Именно на конкурсе iGEM в 2010 году девять студентов из Кембриджского университета решили разработать основанную на люциферазе из светлячков генетическую систему, позволяющую создавать ярко светящиеся организмы. Студенты дополнили ферменты синтеза люциферина ферментом его регенерации, оптимизировали гены для экспрессии в кишечной палочке и провели еще несколько улучшений. В результате они получили штамм бактерий, колбу с которыми можно, например, использовать вместо лампы — такие кишечные палочки дают достаточно света для того, чтобы читать книгу.

О работе студентов писали популярные издания, а сами они уже мечтали освещать дороги при помощи лесополосы из светящихся тополей. Интересно, что даже «зеленая» пресса в тот момент отнеслась к такой фантастической идее благосклонно, рассматривая ее как способ сократить выброс углекислого газа. Но только до тех пор, пока «фантастика» не начала превращаться в реальность.

Мы пойдем в народ

Возникновение дерзкого проекта, поставившего своей необычностью в тупик многих противников ГМО, стало возможным благодаря встрече израильского биолога Омри Амирав-Дрори (Omri Amirav-Drory) и Энтони Эванса (Antony Evans), предпринимателя с математическим бэкграундом, напитавшегося футуристическими идеями в Singularity University. Позднее к ним присоединился Кайл Тейлор (Kyle Taylor), специалист по генетике растений, получивший научную степень в Стенфорде. Оказавшись на одной из лекций, где Омри рассказывал о потенциале синтетической биологии, Эванс впервые услышал об идее кембриджских студентов. И, что называется, загорелся.

Рассчитывать на государственную или даже частную поддержку такого проекта не приходилось, поэтому Эванс, как человек из IT, решил обратиться к краудфандингу на сайте Kickstarter. Этот известный сайт позволяет, например, меломанам финансировать запись альбомов любимых групп, причем если нужную сумму собрать не удается, то неиспользованные деньги возвращаются пользователям.

Эванс поставил целью собрать на создание светящегося растения полмиллиона долларов. Тем, кто перечислил на финансирование по 40 долларов, команда пообещала прислать семена будущего растения для самостоятельного выращивания, по 150 — само растение. Имена тех, кто готов расстаться с 10 тысячами, ученые собираются увековечить в геноме будущего растения (вообще, речь идет о любом послании длиной не более 30 знаков).

Проект вызвал у пользователей Kickstarter нешуточный интерес. За полтора месяца почти вся необходимая сумма была собрана, а те несколько тысяч, которых не хватило, Эванс пообещал добрать за счет продажи футболок и прочей атрибутики. При этом сами растения продаваться не будут — их получат только те, кто уже вложился в проект.

Будущим создателям светящегося растения удалось заручиться поддержкой нескольких известных людей и организаций, среди которых оказались основатель X Prize и Singularity University Петер Диамандис и легендарный генетик Джордж Черч.

В качестве объекта «подсвечивания» ученые выбрали любимое модельное растение генетиков — невзрачную резуховидку Таля Arabidopsis thaliana. Если с ним все пройдет успешно, то на следующем этапе биологи обещают заставить светиться розу.

Интересно, что никаких разрешений для работы «биохакерам», как прозвала их пресса, не требуется. Авторы проекта говорят, что по законам США светящиеся растения не подпадают под регулирование: они не предназначены для употребления в пищу ни для человека, ни для животных, а федеральное аграрное агентство APHIS (Animal and Plant Health Inspection Service) интересуется только способом внесения трансгенов. Если гены люциферазной системы буду внесены в растение методом, в котором не используются патогены (первоначально предполагалось использовать для этого условно патогенную Agrobacterium), APHIS не сможет вмешиваться в работу Эванса и его коллег.

Неудивительно, что такая свобода вызвала у некоторых «зеленых» бурю негодования. Создание светящихся растений они уже назвали лазейкой в законах США, которую «безответственные хакеры» могут использовать так, как им заблагорассудится. Статья, призывающая срочно залатать брешь в законах, появилась, помимо профильной экоактивистской прессы, в The Guardian. Активнее всего повела себя канадская организация ETC Group — она попыталась организовать общественную кампанию, призванную надавить на Kickstarter с целью не давать финансирование «биохакерам».

Сложно сказать, смогут ли Эванс с соратниками преодолеть сопротивление и в срок доставить семена энтузиастам, поддержавшим проект. Пока кажется, что у них на это гораздо больше шансов, чем у AquaBounty с их многострадальным лососем. Ведь «биохакерам», в отличие от AquaBounty, Monsato и других биотехнологических компаний, придется бороться не с американской бюрократией в виде FDA, а с общественным мнением и экоактивистами, которые, к счастью или к сожалению, пока не столь могущественны.