Получено трехмерное изображение человеческой хромосомы

Рис. 1. Получение изображения человеческой хромосомы с помощью когерентной дифракционной рентгеновской микроскопии. Рентгеновские лучи выходят из отверстия диаметром 20 микрометров. В метре от отверстия по направлению распространения рентгеновских лучей расположена облучаемая хромосома. Две щели отсекают сильно расходящиеся лучи, создавая направленный поток рентгеновского излучения. Камера ПЗС, находящаяся на расстоянии 1,32 м от исследуемого объекта, фиксирует дифракционное изображение. Специальный «шлагбаум» на расстоянии 0,335 м блокирует нерассеявшиеся рентгеновские лучи (не несущие никакой информации об образце). Полученные данные используют для создания 2D-изображения хромосомы. Чтобы получить данные, которые позволят восстановить трехмерное изображение, необходимо вращать исследуемый образец. Рис. из обсуждаемой статьи в Phys.Rev. Lett.

Хотя традиционная электронная томография позволяет активно изучать трехмерные структуры клеточных органелл, существуют определенные технические трудности при исследовании крупных биологических объектов. Рентгеновские же лучи обладают уникальным преимуществом, которое позволяет проводить неинвазивный анализ таких объектов с высоким пространственным разрешением. С помощью когерентного рентгеновского дифракционного микроскопа группе японских ученых удалось впервые получить трехмерные изображения человеческой хромосомы, на которых отчетливо видна осевая структура.

В настоящее время одной из самых актуальных тем научных исследований является изучение объектов, размеры которых находятся на стыке макро- и микромира. Есть даже специальное название для такой науки — мезоскопика, или квантовая мезоскопика (от греч. «мезо», mésos — «средний, промежуточный»).

К примеру, размер куперовской пары в низкотемпературном сверхпроводнике составляет порядка десятой доли миллиметра, что позволяет говорить о ней как о мезоскопическом объекте (есть даже такая поднаука — мезоскопическая сверхпроводимость, исследующая, в частности, так называемые эффекты близости на границе раздела нормального металла или ферромагнетика со сверхпроводником). К мезоскопическим объектам следует отнести и так называемые квантовые биты или кубиты — основные элементы для создания квантовых компьютеров. В биологии мезоскопическим объектом можно назвать клеточные органеллы — тоже эдакий «мост» между макроскопическим миром и атомными структурами.

Мезоскопические объекты изучаются, само собой, не только теоретически, но и экспериментально. Однако с экспериментальными методами существует техническая сложность. В силу своих «мезоскопических» размеров они плохо поддаются изучению традиционными методами исследования микромира. Например, для просвечивающего электронного микроскопа такие объекты слишком крупные.

Для мезоскопических исследований лучшего всего подходят рентгеновские микроскопы, посколькурентгеновские лучи обладают высокой проникающей способностью и маленькой длиной волны. Среди них наилучшее пространственное разрешение имеет когерентный рентгеновский дифракционный микроскоп. Он применяется для получения изображения разупорядоченных объектов, то есть тел, не обладающих свойствами периодичности в своем внутреннем строении. Важным преимуществом такого микроскопа является также отсутствие деградации контрастности изображений и аберрации линз: линзы в нём просто не используются. Когерентный рентгеновский дифракционный микроскоп уже может похвастаться своими успехами — с его помощью впервые было получено изображение вируса (см. «Элементы», 26.06.2008).

И вот совсем недавно в журнале Physical Review Letters появилось сообщение о новом достижении этого микроскопа. На сей раз группе японских ученых впервые удалось получить изображение человеческой хромосомы. Под «изображением» подразумевается визуализация (на мониторе компьютера, на бумаге, экране специальной камеры и т. д.) распределения электронной плотности исследуемого объекта — иными словами, информация о том, как электроны этого объекта рассеивают рентгеновские фотоны.

В отличие от обычного светового микроскопа (который навел на объект, подсветил его, сфотографировал, и готово изображение), получить рентгеновское изображение не так-то просто. Необходимо сначала получить качественное (контрастное и четкое) дифракционное изображение, затем специальными математическими методами (как правило, это алгоритм HIO — hybrid input-output) обработать значения интенсивности рассеянного излучения на экране и только после этого «восстановить» электронную плотность исследуемого образца в каждой его точке.

Несколько слов о подготовке эксперимента. Исследователи получали человеческие хромосомы из клеток HeLa, а затем компактным образом химически их фиксировали. Далее такие хромосомы были отложены на нитрид-кремниевую мембрану толщиной 100 нм. Такая вот система и изучалась под когерентным рентгеновским дифракционным микроскопом. Источником рентгеновского излучения для микроскопа была установка SPring-8. На рис. 1 приведена схема экспериментальной установки.

Рентгеновские лучи с энергией 5 кэВ проходили через отверстие 20 микрометров и облучали единичную хромосому. Дифракционное изображение (рис. 2) записывалось камерой с ПЗС-матрицей. Доза облучения составляла 4·10⁸ грэй для единичного измерения (при заданном угле рассеяния) и 2·10¹⁰ Гр для визуализации трехмерного изображения (о нем будет идти речь ниже). Длительность экспозиции — то есть время, в течение которого образец облучался, — составляла 2700 секунд (за исключением данных, приведенных на рис. 2 — в этом случае время экспозиции было 3400 с)

Рис. 2. Распределение интенсивностей рентгеновского излучения, рассеявшегося на человеческой хромосоме (a) и ее двумерная реконструкция изображения в сером (b) и в цветном масштабе (c). Область центромеры указана зеленой стрелкой (b). Реконструированное изображение содержит области высокой интенсивности рассеявшихся лучей, похожие на осевую структуру хромосомы вблизи центра хроматид, как это показано на рис. (с). Величина q определяется как q = 2sin(θ/2)/λ, где λ — длина волны рентгеновского излучения, а θ — угол рассеяния. Рис. из обсуждаемой статьи в Phys. Rev. Lett.

При численном анализе ученые исключали данные, возникающие от рентгеновских лучей, испытывающих сильное рассеяние. После этого, используя упомянутый выше алгоритм HIO, авторы статьи визуализировали сначала двухмерное изображение (проекцию на экран) хромосомы, а затем, продолжив обрабатывать данные дифракционных изображений, собранных при различных углах рассеяния, получили и трехмерную визуализацию — то есть искомое изображение исследуемого объекта (рис. 3).

Рис. 3. Реконструкция 3D-карты электронной плотности человеческой хромосомы или, проще говоря, трехмерное изображение исследуемого объекта. a — поверхностная морфология хромосомы. b, c — поперечные срезы трехмерного изображения хромосомы с наибольшим значением электронной плотности вблизи центромеры (показана белыми стрелками). Они показывают относительно высокую плотность около центральной оси каждой из хроматид. Проекционное изображение d получено из трехмерной реконструкции, подобно изображениям на рисунках 2b и 2c. e — ряд поперечных сечений трехмерного изображения хромосомы в интервале 409 нм. Данные по дифракционному рассеянию, использованные затем для получения трехмерного изображения, получены при следующих значениях углов рассеяния: каждые 2,5°, начиная с –70° до –27,5°, а также –7,5°, –5°, 0°, 5°, 7,5°, 10°, 15°, 17,5°, 20°, 25°, 27,5°, 30°, 37,5°, 40°, 45°, 47,5°, 50°, 55°, 57,5° и 60°. Рис. из обсуждаемой статьи в Phys. Rev. Lett.

Как видно из рис. 3, ученым удалось продемонстрировать не только поверхностную морфологию, но также целую «карту» распределения электронной плотности внутри объекта. Авторы отмечают любопытную особенность: вблизи центромеры электронная плотность имеет наибольшую величину (на рис. 3b и 3с показана стрелками). Вероятно, считают ученые, этот факт может объясняться тем, что область центромеры содержит больше гетерохроматина, то есть вещество в этой области более плотно «упаковано», чем в остальных участках хромосомы.

Расчеты показали, что в процессе двумерной и трехмерной реконструкции изображения пространственное разрешение составило 38 и 120 нм соответственно. Для двумерных изображений такое разрешение, конечно, великовато, но для 3D-рентгенографии этот результат на сегодня лучший.

Таким образом, японским ученым первым удалось получить трехмерное изображение человеческой хромосомы с рекордным на данный момент разрешением, при этом полученные изображения явно демонстрируют наличие осевой структуры, чего не наблюдалось ранее.

Источник: Yoshinori Nishino, Yukio Takahashi, Naoko Imamoto, Tetsuya Ishikawa, Kazuhiro Maeshima. Three-Dimensional Visualization of a Human Chromosome Using Coherent X-Ray Diffraction // Physical Review Letters 102, 018101 (9 January 2009).

Юрий Ерин

elementy.ru