Клещенко Е.
В июльском номере журнала, в статье, посвященной мифам о ГМО, мы упоминали, что одна из реальных, немифических проблем в этой области — перенос пыльцы от трансгенных растений к нетрансгенным сортам или родственным диким видам и в результате появление гибридов. Последствия могут быть разнообразными, в зависимости от того, какие именно растения участвуют в гибридизации. Могут, например, появиться сорные растения, устойчивые к гербицидам (а возможно и обратное: трансгенные растения, опыленные нетрансгенными, утратят ценные свойства). «Зеленые» зачастую выказывают опасения, что гибриды, несущие трансгены, вытеснят исходные дикие виды и нарушат экологическое равновесие. А вдруг нетрансгенные культурные растения приобретут свойства трансгенных? При этом, с одной стороны, будут нарушены права биотехнологической компании, если кто-то бесплатно получит сорт с уникальными свойствами (вспомним дело компании «Монсанто» против канадского фермера Перси Шмейсера), с другой стороны, и производитель, обещавший потребителям «продукт без ГМО», невольно обманет их или же будет вынужден тратиться на анализ собственной продукции. И в конце концов, из самых общих соображений понятно: плохо, когда человек не в состоянии отслеживать и контролировать то, что сам же и создал.
Известно, что вертикальный перенос генов возможен между ГМ-сортами, принадлежащими к семейству крестоцветных, такими, как рапс, канола, и дикими видами. (Вертикальным переносом называется передача генов в результате полового процесса, от родителей к потомству, в отличие от горизонтального переноса — например, у бактерий, поглощающих ДНК из внешней среды.) Крестоцветные вообще склонны к межвидовой гибридизации, а канола способна скрещиваться с десятками диких видов. Мы в свое время писали (см. «Химию и жизнь», 2010, № 10, «В зарубежных лабораториях») о нашумевшем исследовании, которое провели профессор университета штата Арканзас Синтия Сэгерс и ее аспирант Мередит Шафер. Исследовательницы проехали по дорогам Северной Дакоты в общей сложности 5400 км и по пути собирали образцы дикорастущих крестоцветных на обочинах и в трещинах на асфальте — всего 406 растений. С помощью экспресс-тестов они проверяли наличие в них трансгенов, придающих устойчивость к раундапу и другому гербициду, Liberty Link. Дикую канолу они нашли в 46% всех точек, и примерно 83% этой канолы содержали один из двух трансгенов. (Тут надо еще учесть, что обочины дорог в США обрабатывают гербицидом, поэтому быть устойчивым сорняку выгодно.) Некоторые экземпляры оказались устойчивыми к обоим гербицидам сразу — налицо рекомбинация полезных для растения признаков (подробнее о работе Сэгерс, Шафер и их коллег из других институтов можно узнать из публикации: Schafer, M.G. e.a. The Establishment of Genetically Engineered Canola Populations in the U.S. PLoS ONE (2011)6(10)e25736).
Но канола, в конце концов, не приоритетный для нас продукт. А вот как насчет пшеницы?
Мука и пыльца
Не устанем повторять: трансгенные сорта пшеницы пока не допущены к применению в коммерческих масштабах нигде в мире, ни муки из ГМ-источников, ни выпечки из таковой в магазинах быть не может. Однако полевые испытания трансгенных сортов пшеницы ведутся во многих странах. В Европе бушуют протесты под девизом «Заберите обратно муку!» (Take the flour back). Мука появится очень нескоро, но народ уже волнуется. В мае 2012 года более 400 растениеводов, пекарей и просто обеспокоенных граждан из Англии, Ирландии, Шотландии, Уэльса, Франции и Бельгии прошли маршем, протестуя против полевых испытаний ГМ-пшеницы, устойчивой к тлям, которые запланированы на 2012—2013 год в графстве Хардфордшир, Великобритания (исследовательская станция «Rothamsted Research»). Налогоплательщиков пугает, ко всему прочему, еще и то, что трансгены этой пшеницы не найдены в природе, один из них сходен с геном мяты, другой — с геном коровы (рис. 1).
 |
|
1
Картинка с сайта «Take the floor back!». Согласно словарю Фасмера, каравай, или коровай, происходит от «коровы» — возможно, ритуальный хлеб преподносили гостям или богам, когда не могли подать мяса. Но продовольственные проблемы не убеждают «зеленых»: пшеница с геном, «похожим на коровий», для них остается злом.
|
В перечне опасений борцов с трансгенными делянками есть и «пищевой суверенитет», и потенциальный вред ГМО для здоровья, и переход от разнообразия сортов к монокультурам, которые однажды могут оказаться неустойчивыми к новым вредителям и оставить без хлеба весь мир. Но первым в списке угроз стоит перенос трансгенов — как вертикальный, посредством опыления, так и горизонтальный (в том числе в почвенные микроорганизмы и микрофлору кишечника человека).
Не будем обсуждать перенос генов растения в бактерии, но какова вероятность того, что ГМ-пшеница опылит обычную? Может быть, и в самом деле надеть на каждый куст полиэтиленовый мешок, пока не случилось непоправимого? Или высаживать в открытый грунт только сорта с мужской стерильностью, не продуцирующие пыльцу?
Один из возможных экспериментов, способных внести ясность в этот вопрос, выполнили исследователи из пущинского филиала Института биоорганической химии им. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова РАН. Нам кажется, читателям «Химии и жизни» будет интересно узнать, как правильно проводить подобные эксперименты.
Пшеница — не канола, вероятность переопыления у этого вида, как хорошо известно ботаникам и агрономам, невелика. Пшеница мягкая, Triticum aestivum L. — растение однолетнее, самоопыляющееся, с тяжелой и не слишком обильной пыльцой, примерно 90% которой оседает в радиусе трех метров. (Впрочем, небольшое количество пыльцы может переноситься ветром и на 50—60 м.) Частота переопыления у мягкой пшеницы — самая низкая среди злаковых культур, в зависимости от сорта составляет 0,5—10%. Вот почему Европейское агентство по окружающей среде и Европейский научный фонд считают пшеницу культурой с очень низким риском вертикального переноса трансгенов. Но «очень низкий» не означает «нулевой», и, конечно, хотелось бы численно выразить этот риск.
С конца ХХ века вертикальный перенос трансгенов исследовался у кукурузы, сорго, риса, ячменя. На пшенице подобные опыты проводили в основном с нетрансгенными сортами, опыты на трансгенах единичны и результаты скорее качественные. Этот пробел решили восполнить российские исследователи. К пшенице и хлебу в нашей стране всегда было особое отношение, и о своей муке наши люди будут беспокоиться не меньше, чем граждане Великобритании...
Круги на поле
Опыты, о которых рассказывается в журнале «Сельскохозяйственная биология» (см. ссылку в конце статьи), проводили в течение двух сезонов, в 2004 и 2005 году. Источником пыльцы были трансгенные растения яровой пшеницы сорта Андрос. Получили их на станции искусственного климата «Биотрон» в Пущине.
«Биотрон» — одно из научных подразделений Института биоорганической химии РАН. Этот уникальный научно-производственный комплекс, созданный в 1991 году, позволяет проводить разнообразные исследования в области биотехнологии растений и генетической инженерии. В лаборатории разрабатываются агробактериальный и баллистический методы получения трансгенных плодовых, ягодных, овощных, зерновых и декоративных культур с новыми хозяйственно- ценными признаками. (Агробактериальный метод — внесение трансгенов в клетки растения с помощью плазмид, то есть кольцевых молекул, микроорганизмов рода Agrobacterium. Баллистический метод, или метод генной пушки, предполагает бомбардировку клеток микрочастицами твердого вещества, несущими ДНК.) За последние пятнадцать лет сотрудники станции «Биотрон» получили более тысячи независимых трансгенных растений различных культур, в том числе пшеницу, томат, яблоню, грушу, сливу, морковь, ряску, хризантему, гвоздику, землянику. Кроме того, здесь ведутся работы по клонированию растительных генов и созданию современных векторных конструкций для трансформации растений. Начиная с 2001 года наиболее перспективные трансгенные формы проходят полевые испытания под наблюдением сотрудников станции. Среди этих трансгенных форм — линии яровой пшеницы, устойчивые к гербициду, о которых и пойдет речь.
Векторную конструкцию вводили в клетки пшеницы с помощью генной пушки. В итоге получались растения, содержащие ген ацетилтрансферазы bar под контролем промотора ubi1 из кукурузы, а также ген зеленого флуоресцентного белка gfp под действием промотора act1 из риса. (Промотором называется участок ДНК, управляющий активностью гена.) Зеленый флуоресцентный белок GFP, как без труда догадаются наши постоянные читатели, был нужен для облегчения детекции трансгенов: этот белок, состоящий из одной аминокислотной цепочки, светится при ультрафиолетовом облучении (см., например, «Химию и жизнь», 2012, № 7). Фермент ацетилтрансфераза придает трансгенным растениям устойчивость к гербициду.
Трансгенная пшеница росла на специальном карантинном участке, удаленном от промышленных полей не менее чем на 10 км. Семена высевали в круге диаметром 1 м, а вокруг сажали нетрансгенную пшеницу того же сорта: в 2004 году — на расстоянии 1 м от центрального круга, в два ряда с междурядьем в 10 см, в 2005-м — тремя кругами на расстоянии 1, 2 и 3 м от внешнего периметра (рис. 2). Первый круг был сплошным, два внешних состояли из восьми отрезков, ориентированных по сторонам света, каждый длиной в метр. На такие же восемь секторов при уборке «урожая» делили и первый круг — это позволяло оценивать, как воздействуют направление и сила ветра на вероятность опыления.
 |
2
Схема опытной делянки 2005 года: в центральном кругу — трансгенная пшеница, вокруг посевы нетрансгенной. В виде многоугольника показана обратная роза ветров, то есть преобладающие направления ветра. Точками условно обозначены случаи опыления трансгенной пыльцой в каждом секторе |
Трансгенная и нетрансгенная пшеница развивались синхронно, одновременно колосились, выходили в трубку, затем цвели, как и положено яровой пшенице, в конце июня — начале июля. И в первый, и во второй год преобладали западное, северо-западное и северное направления ветра, причем во второй год скорость ветра была ниже (то есть пыльцу он мог унести не так далеко).
В 2004 году ученые собрали всего 62221 семя в «нетрансгенных рядах», в 2005-м более 125 тысяч. (Урожай был больше за счет добавления двух внешних рядов, вообще же условия для пшеницы в том году были хуже, и урожай с того же внутреннего круга снизился.)
Чтобы не ждать еще год, семена первого поколения высевали в зимние теплицы. Когда всходы подрастали, их обрабатывали 1%-ным раствором гербицида Баста (Bayer Crop Science, Германия). Через неделю выжившие растения (то есть, возможно, трансгенные) пересаживали в отдельные горшки (рис. 3).
 |
|
3
Растения первого поколения на стеллажах. Колоски, выжившие после обработки гербицидом, показаны стрелками
|
Пыльцу растений исследовали под световым микроскопом, отыскивая те, которые при облучении давали зеленую флуоресценцию. Пыльца удобна тем, что в ней нет хлорофилла, — сам будучи зеленым, он маскирует присутствие GFP. Кроме того, из растений, устойчивых к гербициду, выделяли геномную ДНК и всю матричную РНК (мРНК). Если ген активен, на нем синтезируется мРНК — потому она так и называется, что становится матрицей для белкового продукта. Наличие интересующих последовательностей и в геноме, и в мРНК проверяли с помощью полимеразной цепной реакции, или ПЦР (в случае РНК для этого используется так называемая ПЦР с обратной транскрипцией). Чем замечателен этот метод — какая бы смесь ДНК ни содержалась в образце, синтезируется в большом количестве только искомый фрагмент. Конечно, если он присутствует в образце. Таким образом, появление продукта ПЦР говорило о том, что данное растение действительно получило гены ацетилтрансферазы и (или) зеленого флуоресцентного белка путем вертикального переноса, от трансгенного «отца». Теоретически потомкам мог достаться только один из двух «чужих» генов, на практике же они наследуются сцепленно, что и неудивительно — они вводились в геном в составе одной векторной конструкции.
Теперь переходим к самому интересному — результатам.
Не далее нескольких метров?
В 2004 году гербицид убил 99,5% растений первого поколения в теплицах. Что собой представляли устойчивые полпроцента, или 259 растений?
Во-первых, сразу видна была зависимость от направления ветра: на северных и северо-западных участках гибридных семян, из которых выросли устойчивые растения, было в несколько раз меньше, чем на южном и юго-восточном. (На всякий случай напомним, что северным называется ветер, который дует с севера на юг, а не наоборот.)
Во-вторых, у всех этих растений наличествовали и оба трансгена, и их мРНК (то есть гены были активны), а пыльца флуоресцировала под микроскопом — значит, и GFP синтезировался. Вертикальный перенос налицо, передача по наследству специфических признаков — тоже.
Но было бы очень странно, если бы на расстоянии в метр, да под открытым небом, где дует ветер, пыльца с трансгенных растений совсем не попала бы на обычные. А что произойдет с увеличением расстояния?
На второй год во всех трех кругах выросло 78 устойчивых к гербициду растений. Из них на расстоянии 1 м от центрального круга обнаружилось 64 растения, на расстоянии 2 м — 13, на расстоянии 3 м — всего одно. Как и на первый год, все эти растения имели в геноме трансгены, и точно так же их распределение по сторонам света коррелировало с господствующими направлениями ветра.
Однако направление ветра — лишь косвенное свидетельство. Как доказать, что трансгенные экземпляры во внешних кругах — действительно результат гибридизации, а не выросли, например, из трансгенных семян, случайно подмешавшихся к нетрансгенным? Для этого исследовали второе поколение — семена растений, выращенных в теплице: проверяли, не флуоресцируют ли зародыши на вторые-третьи сутки после прорастания.
Тут уже в ход идет классическая генетика. Если растение с трансгенными признаками — гибрид, то у него одна копия приобретенных генов, оно гетерозиготно по этим генам. Следовательно, при самоопылении у потомков такого растения будет расщепление признаков 3:1 (то есть три четверти будут иметь трансгенные признаки, одна четверть будет обычной; так получается потому, что трансгены доминантны). У обычного же ГМ-растения никакого расщепления признаков в потомстве не будет, все они будут такими же, как родитель. Однако второе поколение действительно повело себя так, как полагается потомству гибрида: флуоресценция наблюдалась у трех четвертей потомства.
В итоге частота вертикального переноса трансгенов на расстоянии 1 м составила в первый год 0,416%, во второй — 0,134%. Разницу можно отнести за счет различия в погодных условиях, например более слабого ветра во второй год, а также более короткого цветения. При удалении на 2 и 3 метра частота упала до 0,035% и 0,002% соответственно.
Казалось бы, выводы успокоительные: при километровых расстояниях вероятность переноса пыльцы падает до нуля? Однако не все так просто. В этом же эксперименте видно, какое большое значение имеют направление и сила ветра, температура и влажность и прочие фенологические характеристики, влияющие на продолжительность цветения. Ясно также, что более обширные поля ГМ-пшеницы могут оказаться более «вирулентными» — просто за счет большего количества пыльцы.
Научная публикация — дело небыстрое, и в свежем номере «Сельскохозяйственной биологии» представлены результаты опытов, проводившихся семь лет назад. Мы обратились к авторам работы с вопросом: какие еще результаты появились с тех пор?
— В 2008 году мы провели еще один полевой эксперимент, в котором использовали те же сорта и трансгенные линии, что и в предыдущих исследованиях, — рассказывает кандидат биологических наук, старший научный сотрудник станции «Биотрон» Дмитрий Николаевич Мирошниченко. — Однако в этот раз анализ вертикального переноса генов с трансгенной пыльцой проводили на двух участках. На одном, как и в предыдущие годы, трансгенные семена пшеницы высевали в круге диаметром 1 м, а на втором засеваемый круг был увеличен до трехметрового диаметра. Кроме того, было решено «отодвинуть» нетрансгенные растения на большее расстояние, поэтому их высевали через 1, 3 и 5 м от внешнего периметра трансгенного круга. Как и в предыдущих исследованиях, круг на расстоянии 1 м был сплошным, а два внешних состояли из восьми отрезков, ориентированных по сторонам света, каждый длиной в метр (рис. 4).
 |
|
4
На фото — эксперимент 2008 года (вверху — центральный круг диаметром 1 м, внизу — диаметр увеличен до 3 м, а нетрансгенные ряды в обоих случаях отодвинуты дальше, чем в предыдущие годы, — на 1, 3 и 5 м)
|
В конце вегетации мы собрали все колосья с нетрансгенных растений пшеницы и получили 525 тысяч семян с обоих участков. Семена прорастили в теплицах и обработали гербицидом на предмет их устойчивости, затем провели анализ ДНК и РНК растений, проследили наследование в последующем поколении. В результате мы обнаружили 643 устойчивых к гербициду растения, причем 91% вырос из семян нетрансгенных растений, растущих на расстоянии одного метра от трансгенного круга. В итоге частота вертикального переноса трансгенов на расстоянии 1 м составила на первом участке 0,225%, на втором — 0,306%. Мы ожидали более высоких значений вертикального переноса на втором участке за счет большего количества переносимой пыльцы, поскольку трансгенных растений в трехметровом круге было больше в девять раз. Однако частота вертикального переноса увеличилась лишь в 1,36 раза. Таким образом, подтвердилось, что при увеличении расстояния частота переноса трансгенов резко падает. На участке с «трансгенным кругом» метрового диаметра вертикальный перенос на расстоянии трех метров составил 0,021% (уменьшение в 10 раз), при удалении на 5 м — 0,009% (уменьшение в 25 раз). На втором участке частота переноса трансгенов на 3 м была выше — 0,036% (уменьшение в 8,5 раз), тогда как на 5 м она достигла того же значения, что на первом участке — 0,009% (уменьшение в 34 раза).
Как и в предыдущие годы, частота вертикального переноса генов с пыльцой зависела от преобладающего направления ветра. Эта тенденция хорошо прослеживалась на участке с однометровым трансгенным кругом, но была менее явной на участке с трехметровым трансгенным кругом. В отличие от 2004 и 2005 годов во время цветения не было столь явного преобладающего ветра, но точно так же северо-восточный, восточный и юго-восточный ветры почти не наблюдались. В результате перенос трансгенов на растения, находящиеся в направлении этих ветров, также был самым низким. В целом данные 2008 года подтвердили наши наблюдения прошлых лет. Позитивный результат состоит в том, что даже при девятикратном увеличении объема трансгенной пыльцы она по- прежнему не переносится на большие расстояния, а оседает в пределах 1—3 метров от трансгенного растения. Следовательно, соблюдение мер пространственной изоляции должно обеспечить отсутствие перекрестного опыления у сортов пшеницы и предотвратить перенос трансгенов с пыльцой.
Конечно, нам бы хотелось продолжить наши исследования, проанализировать возможность переноса трансгенов между разными сортами, изучить вероятность переноса на большие расстояния (до 200 м) при более крупных центральных участках, а также исследовать некоторые другие вопросы биобезопасности трансгеных растений пшеницы. Но пока, к сожалению, найти финансирование на эти исследования нам не удается.
Фотографии предоставлены Д.Н. Мирошниченко.
Литература
Д.Н.Мирошниченко, М.В.Филиппов, С.В.Долгов. Анализ вертикального переноса генов от трансгенных к нетрансгенным растениям пшеницы (Triticum aestivum L.). «Сельскохозяйственная биология», 2012, № 3, с. 37—45
Источник: Химия и Жизнь №9, 2012 г..
Рейтинг публикации:
|
