Thi Hoang Duong Nguyen et al / Nature 2018
Ученые с помощью криоэлектронной микроскопии получили самую детальную на сегодняшний день структуру теломеразы человека — фермента, который обеспечивает бессмертие клеток, в том числе, опухолевых. Статья с описанием тонкостей строения фермента в комплексе с его субстратом — ДНК, опубликована в Nature.
Механизм репликации ДНК требует для начала синтеза новой цепи наличия короткой «затравки», которая потом уничтожается. Это приводит к тому, что на самом конце молекулы ДНК остаются недореплицированными короткие кусочки, то есть концы хромосом с каждым раундом репликации укорачиваются. Сохранить важные части хромосомы от концевой недорепликации помогают теломеры — области на концах хромосом, состоящие из повторяющихся последовательностей, которые по сути представляют собой «запасную» ДНК. Длина теломер ограничивает число клеточных делений определенным значением (это значение называют пределом Хейфлика). В «бессмертных» клеточных линиях, к которым относятся стволовые и раковые клетки, длина теломер поддерживается на постоянном уровне ферментом теломеразой.
Благодаря участию в процессах канцерогенеза теломераза представляет интерес для ученых в качестве мишени для терапии рака — вещества, подавляющие ее активность, могут останавливать рост опухоли. Однако для рациональной разработки эффективных ингибиторов фермента необходимо в деталях представлять его структуру. Общий план строения теломеразы довольно хорошо изучен — ее основным компонентом является субъединица с функцией обратной транскриптазы (TERT), которая синтезирует теломерную ДНК на РНК-матрице, роль которой выполняет РНК-часть теломеразы (TR).
Несмотря на принципиально схожую схему работы фермента, у разных организмов теломераза может включать дополнительные субъединицы, а TERT может состоять из разных доменов. До сих пор самая лучшая структура с разрешением в девять ангстрем была получена для теломеразы инфузории тетрахимены, а для человеческого фермента, который представляет основной интерес для медиков, достаточно качественных данных о структуре не было. Исследователи из университета Калифорнии в Беркли под руководством Кэтлин Коллинз (Kathleen Collins) при помощи криоэлектронной микроскопии получили изображения человеческой теломеразы, связанной с субстратом, в субнанометровом разрешении.
Необработанные изображения частиц теломеразы
Thi Hoang Duong Nguyen et al / Nature 2018
Поделиться
Для того, чтобы получить частицы для микроскопии, ученые сверхэкспрессировали гены, кодирующие TERT и TR в клетках человека, а затем очистили комплекс белка и РНК таким образом, чтобы сохранить вспомогательные субъединицы. После этого активность комплекса проверили in vitro и in vivo. Для детального изучения взаимодействия фермента с ДНК к препарату добавили субстрат — олигонуклеотид, содержащий структурную единицу последовательности теломерной ДНК.
Оказалось, что частицы из активной фракции состоят из двух ассиметричных долей, соединенных гибкой перемычкой. Полученные изображения замороженных частиц помогли выяснить точное расположение молекулы РНК внутри комплекса. Кроме того, ученым удалось уточнить детали взаимодействия основных компонентов теломеразы с вспомогательными белками семейства H/ACA, которые вносят модификации в РНК и участвуют также в биогенезе рибосом. Мутации в генах этих белков приводят к развитию ряда наследственных синдромов у человека. Выяснилось, что одна из долей активного фермента представляет из себя TERT-субъединицу, связанную с РНК и ДНК, а вторая часть молекулы РНК связывает вспомогательные белки. Для каталитической и вспомогательной долей фермента были получены структуры с разрешением 7,7 и 8,2 ангстрем соответственно.
Детальная структура теломеразы с указанием каталитического и "вспомогательного" доменов
Thi Hoang Duong Nguyen et al / Nature 2018
Поделиться
Подробнее про принцип работы криоэлектронной микроскопии — метода, при помощи которого удалось получить ряд важных для биологии и медицины данных, например, о строении амилоидной фибриллы, и за разработку которого в 2017 году была присуждена Нобелевская премия по химии, можно прочитать в нашем материале «Тени во льду».
