Больничные инфекции оказались генетически стабильными

Обычный вид бактерии Pseudomonas aeruginosa (слева) и она же после тридцатипятилетней эволюции в условиях больницы (справа). Фото с сайта www.pnas.org

Датские ученые проследили генетические изменения бактерии Pseudomonas aeruginosa, которые произошли за 35 лет в пределах одной больницы. Наиболее успешный и частый штамм этой бактерии вызывал заболевание дыхательных путей у ряда больных и, несмотря на лечение, мог сохраняться у одного и того же пациента в течение многих лет. На основании этих данных ученым удалось доказать, что внутрибольничные инфекционные возбудители после периода быстрых адаптаций изменяются относительно мало, скорость мутирования у них низкая, диверсификации и расщепления на отдельные линии не происходит. Эти наблюдения контринтуитивны, так как долгая эволюция в нестабильных условиях должна была бы способствовать повышению генетического разнообразия.

Ученые из Датского технологического университета, Копенгагенского университета и Королевского госпиталя в Копенгагене исследовали распространение и эволюцию штаммов бактерии Pseudomonas aeruginosa, циркулирующей в пределах одной из больниц Копенгагена. Они изучили динамику генетических изменений у этой бактерии, происходивших в течение 35 лет (с 1973-го по 2008 год). Для этого они использовали бактериальные штаммы, выделенные в анализах больных муковисцидозом и хранящихся в больнице с 70-х годов прошлого века. Муковисцидоз — это тяжелое наследственное заболевание, которое всегда осложняется инфекциями пищеварительной системы и дыхательных путей. Pseudomonas aeruginosa в данном случае была источником инфекций дыхательных путей.

Среди различных штаммов Pseudomonas aeruginosa один — он именовался DK2 — встречался наиболее часто, и его присутствие отмечалось в течение более или менее длительного промежутка времени. Ученые подчеркивают, что выбор штамма DK2 был обусловлен именно значительной продолжительностью его присутствия в больничной среде и, следовательно, возможностью отследить более или менее содержательную историю его изменений.

DK2 обнаружился у 6 пациентов в 46 тестовых пробах. В 1973 году в пробах присутствовало 4 варианта DK2 (с различными мутациями двух значимых регуляторных генов), распределенных в 46 пробах. После того как в 1974-м и 1975 году умерли пациенты — носители двух вариантов, — из четырех вариантов осталось два, а когда в 1991 году умер еще один пациент (его анализы отмечены 1979 годом), остался только один вариант этого штамма. Именно он и развивался в течение последующих 15 лет, и его динамика прослежена на базе 9 аналитических проб.

Нет никаких признаков того, что вымершие три варианта оставили хоть каких-то наследников. Так что этот последний вариант оказался предком всех последующих поколений штамма DK2 в данной больнице. Какова была ситуация до обнаружения данного штамма в анализах 1973 года — неизвестно, так как более старых анализов больница не хранит. Однако по некоторым признакам ученые смогли предположить, что незадолго до 1973 года больничный штамм Pseudomonas aeruginosa пережил период высокой мутационной изменчивости, а интересующий нас предковый вариант DK2 близок к исходному контрольному штамму Pseudomonas aeruginosa.

Итак, один вариант штамма в течение 35 лет дал около 200 000 поколений, изменился, переходя от одного пациента к другому. В связи с высокой неоднородностью условий и длительным (для бактерий) временем эволюционирования можно было бы ожидать широкой генетической диверсификации исходного штамма. По крайней мере, именно это происходит в условиях «эволюции в пробирке».

Датские микробиологи, основываясь на своих данных, не смогли подтвердить это внешне непротиворечивое предположение. Были прочитаны генетические последовательности 12 изолятов и по ним составили представление о числе мутаций, произошедших за период в 35 лет. Всего зафиксировано 368 нуклеотидных замен, из них четверть составляют синонимичные (нейтральные) замены. Филогенетическое древо этих изолятов выстроилось в хронологически последовательный граф с малым числом ветвей. Разнесенные во времени изоляты, взятые у одного и того же пациента, составляют единую ветвь (и таких ветвей две, то есть имеется хронологическая цепочка анализов двух пациентов). Два последовательных изолята, взятых у третьего пациента (на графике внизу он обозначен красным треугольником CF173), оказались на разных ветвях; при этом более поздний (2005 год) расположен ближе к корневому узлу, чем более ранний (1984 год). По мнению микробиологов, это говорит о повторном инфицировании пациента в 2005 году одним из более «старых» вариантов штамма.

Филогенетическое древо 12 изолятов: цветными символами обозначены изоляты для шести пациентов, рядом со значком указан год взятия анализа; для пациентов 43, 114 и 30 имеется только по одному анализу, для остальных — по несколько; проба 66, взятая в 1973 году (желтый шестиугольник), оказалась предковой по отношению к девяти остальным. Схема из обсуждаемой статьи в PNAS

Так или иначе, выяснилось, что, хотя внутренняя среда больного пациента весьма неустойчива и разнородна из-за инфекций и постоянного лечения всевозможными препаратами, эта разнородность не способствует быстрому увеличению генетического разнообразия. Заражение разных больных также не приводит к быстрому увеличению генетического разнообразия. Скорость изменений остается более или менее постоянной и сравнимой со средними темпами мутирования у этого вида бактерий.

Динамика накопления нуклеотидных замен: как видно из графика, скорость мутации более или менее постоянная. Значительный разброс заметен только в начальной точке — 1973 год. График из обсуждаемой статьи в PNAS

Сравнение темпов синонимичных и несинонимичных нуклеотидных замен позволяет судить о работе отбора — был ли он направленным или стабилизирующим. Направленный отбор приводит к повышенной доле несинонимичных замен, а стабилизирующий отбор отличается уменьшенной долей несинонимичных замен. Судя по имеющимся данным, до 1979 года отбор способствовал формированию успешного варианта DK2 (красный кружок на схеме), а после работал стабилизирующий отбор. Та же самая картина выявляется и при анализе экспрессии генов различных изолятов: до 1979 года их биохимические портреты были резко различными, а после 1979 года различия свелись к минимуму.

Авторы подчеркивают, что именно на первой стадии адаптационного процесса (до 1979 года) произошли изменения в важнейших регуляторных генах, выполняющих множественные функции в бактериальном метаболизме. В действительности, мутации всего в трех регуляторных последовательностях обеспечили успешное распространение штамма DK2: все пробы, датированные после 1979 года — а таких нашлось 40, — имеют эти три мутантные гена.

Прежде считалось, что, попадая в организм, бактерия начинает изменяться ускоренными темпами, и темпы направленного отбора сохраняются более или менее высокими. Видимо, прежние исследования улавливали только начальные стадии направленного гипермутирования, а последующая стабилизация упускалась.

Параллельная эволюция бактерий у двух пациентов привела к формированию трех новых признаков, но за счет разных мутаций: гены PA5160 и mexY связаны с транспортом лекарственных препаратов, gyrA обеспечивает устойчивость к ципрофлоксацину; также выявлены делеции, ведущие к потере способности разлагать 4-HPA. Схема из обсуждаемой статьи в PNAS

Для двух пациентов (CF333 и CF173) прослежены случаи параллельной эволюции. Ясно, что больной пациент становится для микробов более или менее изолированной ареной эволюции. Поэтому сходные новшества, обнаруженные у бактерий, заразивших разных пациентов, следует приписывать параллельной конвергенции. Три полезных для бактерии признака (и вредных для пациентов) были приобретены независимым путем и за счет разных мутаций. Эти признаки связаны с увеличением устойчивости к некоторым антибиотикам.

Таким образом, эволюционный маршрут внутрибольничной инфекции Pseudomonas aeruginosa оказался в некоторых аспектах неожиданным, но с другой стороны — вполне предсказуемым. Неожиданными для ученых оказались два момента. Во-первых, четкое деление этапов этого пути: начальный адаптивный и последующий стабильный. Начальный этап закончился за несколько лет, а последующий продолжался десятилетия. Прежние исследования давали основания полагать, что для внутрибольничных инфекций характерна постоянная высокая скорость мутирования.

Второй вывод, удививший исследователей, — низкое разнообразие генотипов больничного штамма у разных больных, несмотря на резко неоднородную и неустойчивую среду обитания бактерий. Все эксперименты по эволюции бактерий в условиях лабораторных сосудов и сред приводили к постепенному увеличению разнообразия и дифференцировке генотипов отдельных линий. В случае нестабильных естественных условий ни существенного роста разнообразия, ни вычленения отдельных линий не обнаружено.

Источник: Lei Yang, Lars Jelsbak, Rasmus Lykke Marvig, Søren Damkiær, Christopher T. Workman, Martin Holm Rau, Susse Kirkelund Hansen, Anders Folkesson, Helle Krogh Johansen, Oana Ciofu, Niels Høiby, Morten O. A. Sommer, Søren Molin. Evolutionary dynamics of bacteria in a human host environment // PNAS. Published online before print April 25, 2011.

Елена Наймарк