ДНК-идентификация личности в России

С приветствием к участникам обратился руководитель Thermo Fisher Scientific в России Алексей Хижняк. Он напомнил, что компания присутствует на российском рынке три десятилетия; в частности, бренд Applied Biosystems, хорошо известный отечественным молекулярным биологам, — составная часть Thermo Fisher. В компании 70 000 сотрудников, 5 000 научных работников и инженеров; ежегодно около 1 млрд. долларов инвестируется в исследования. Основные направления деятельности Thermo Fisher — науки о жизни, здравоохранение, производство фармпрепаратов; среди прикладных направлений видное место занимает криминалистика. Совсем недавно, в 2018 году, в Санкт-Петербурге начала работу линия по производству наборов для идентификации личности.

Специалист по научной поддержке компании Александр Гентош выступил с обзором новых решений в области HID. Он отметил, что эти решения охватывают весь технологический процесс: сбор биоматериала на месте преступления или получение сравнительных образцов от людей, выделение ДНК, количественный анализ, амплификацию STR-локусов, анализ данных, массовое параллельное секвенирование (NGS). Затем он перечислил новинки, предлагаемые компанией для каждого этапа; рассказал, в частности, о генетическом анализаторе SeqStudio. Подготовленный образец просто помещают в картридж, и на выходе получают результаты секвенирования или фрагментного анализа (в том числе анализа STR). Картридж содержит универсальный полимер, подходящий для обоих приложений; рассчитан на 1000 образцов и стабилен в приборе до 6 месяцев (что полезно для лабораторий с невысокой пропускной способностью).

Значительная часть доклада посвящена была работе с запросами потребителей, что делается для того, чтобы облегчить интерпретацию данных, увеличить число образцов, проходящих с первого раза, повысить пропускную способность приборов серии 3500 и добавить им гибкости. «Представьте, что вы пришли утром в лабораторию, поставили электрофорез, две полных плашки, запустили, а через час пришел начальник: слушай, вот экспертиза, надо еще вчера ее сдать. Что в этом случае делать?» Теперь необязательно прекращать одну работу, чтобы начать другую: появилась возможность поставить прибор на паузу, создать новую плашку, поместить ее в прибор, изменить порядок инжекции, поставив вперед срочные образцы, и продолжить электрофорез. Обсудили конкретные проблемы, возникающие у пользователей: как уменьшить число пуллапов (двойных пиков при секвенировании, меньший под большим, которые приходится интерпретировать «вручную»), почему они могут возникнуть, какими опциями в каких случаях правильнее пользоваться, и т.д.

Аудитория без восторга приняла сообщение о том, что программное обеспечение от Thermo Fisher переходит на Windows 10, поскольку Windows 7 более не поддерживается производителем, но всем было понятно, что это неизбежно.

О локализации HID наборов в РФ рассказал начальник производства подразделения HID АО «Термо Фишер Сайентифик» Сергей Черепанов. Строительство производственного комплекса в Санкт-Петербурге началось в 2017 году, в 2018-м уже была выпущена первая промышленная партия, в 2019 году официально подтвержден статус продукции «Сделано в России». За полтора года произведено более 3000 наборов, жалоб и возвратов не было, все обязательства по контрактам выполнены. Сырье поступает из Великобритании, рассказал Сергей Черепанов; продукцию хранят при -20^оС. На производстве есть две чистых комнаты класса ISO7, где работают в спецкостюмах, а специальная вентиляционная система обеспечивает повышенное давление в помещении и предотвращает попадание воздуха снаружи. «Мы уже сейчас работаем по стандарту ISO 9001 и делаем шаги к стандарту ISO18385», — сказал Сергей Черепанов (этот стандарт говорит о минимизации загрязнения ДНК), В дальнейших планах локализация контроля качества в России, локализация новых продуктов (например, VeriFiler Plus — не позднее 1 квартала будущего года).

Докладчику задали вопрос, не планирует ли компания участвовать в госзакупках. Ответ Сергея и других сотрудников компании был следующий: на сегодняшний день эта задача сопряжена со значительными сложностями, пока что продукция будет распространяться через компанию-дистрибьютора.

Дистрибьютора продукции HID Thermo Fisher Scientific, компанию «ИнтерЛабСервис», представлял советник по стратегическому развитию ИЛС Герман Шипулин. «ИнтерЛабСервис», отметил он, лидирует на рынках РФ и СНГ, свою историю в 2002 году она начинала с трех человек, а сейчас в компании 350 сотрудников; дистрибуцией оборудования, наборов и расходных материалов для криминалистических ДНК-экспертиз «ИнтерЛабСервис» занимается более 6 лет. Партнером Thermo Fisher Scientific компания стала с 2017 года и уже в 2018 году получила сертификат лучшего партнера по направлению криминалистики. Со своей стороны, Герман Шипулин отметил, что работать с Thermo Fisher приятно и легко, «это мнение всех наших сотрудников».

Среди продукции Thermo Fisher, которую могут приобрести российские экспертно-криминалистические центры и Бюро судмедэкспертизы, — станция для выделения ДНК «AutoMateExpress», амплификатор «QuantStudio5», наборы для амплификации STR-локусов, для выделения ДНК, ее качественной и количественной оценки, капиллярный секвенатор ABI 3500. Станут доступными инновационные технологии, такие как система для NGS-секвенирования «Precision ID», одобренная ФБР для секвенирования мтДНК в криминалистических целях. «Мы подписали соглашение с Институтом общей генетики, там Евгений Иванович Рогаев и другие. Они получили порядка двух миллиардов в рамках программы Союзного государства на создание панелей, специфичных для Российской Федерации. Вы знаете, что есть панель Precision ID у компании Thermo Fisher, Precision ID Ancectry, но она, к сожалению, может типировать людей только до континента — субконтинента. Мы надеемся, что наконец получим маркеры, более специфичные для России, и это поможет нашей аналитической службе более глубоко проводить исследования на основе отечественных разработок, адаптированных под этот прибор», — сказал Герман Шипулин. (Подробнее о программе «ДНК-идентификация» Союзного государства см. интервью со Светланой Боринской на PCR.news.) Еще одна долгожданная инновация — система для быстрой идентификации личности RapidHIT ID: образец помещают в картридж, вставляют его в прибор и через 90 минут получают готовый результат.

Даже самое умное устройство бесполезно в руках неумелого пользователя. В Российском центре судмедэкспертизы Минздрава работает образовательная программа по молекулярной генетике. Заведующая отделом молекулярно-генетических экспертиз РЦСМЭ, врач — судебно-медицинской эксперт высшей категории Елена Земскова рассказала о долгожданной новости — первом цикле дополнительного профессионального образования по теме «Экспертное применение анализа митохондриальной ДНК в судебно-медицинской практике».

Потребность в обучении специалистов по ДНК-идентификации в криминалистике появилась еще в нулевые годы. «Наша деятельность началась в инициативном порядке, — говорит Елена Земскова. — Мы сами, откликаясь на многочисленные просьбы коллег из регионов, решили это организовать. Государство, к сожалению, не готовит специалистов такого узкого профиля, проблема кадров до сих пор большая не только в России, но и в мире». Образовательная программа начала работу 13 лет назад, в 2006 году, с тех пор было проведено 52 учебных цикла, подготовку прошли около 350 экспертов, в том числе более 30 заведующих судебно-биологическими отделами региональных Бюро судмедэкспертизы. Учиться хотят не только сотрудники госструктур, но и эксперты из коммерческих организаций.

Анализ мтДНК в криминалистике может использоваться для установления отдаленного кровного родства по материнской линии, идентификации останков, в работе с сильно деградированными образцами. Но здесь пока еще нет готовых решений «помести образец в прибор и получи результат», работа требует высокой квалификации, понимания сути. Елена Земскова приводила примеры, когда хорошие данные интерпретируются неверно: скажем, когда в катастрофе погибли родственники, имеющие идентичную мтДНК, эксперт может не понимать, что исследование мтДНК в этом случае устанавливает не личность, а принадлежность к семейной группе! Встречается и неумение распознать плохие данные секвенирования, непригодные для анализа (именно с такими данными дилетант-«эксперт» выступал на телевидении по поводу гибели знаменитой группы Дятлова; правда, как добавил в конце доклада коллеги Павел Иванов, этот человек позднее выразил желание поучиться на курсах).

Когда в РЦСМЭ решили написать программу курсов повышения квалификации по анализу мтДНК, помощь оказывали Applied Biosystems и российская компания «Гордиз». На курсах рассматривали не только рутинные случаи, но и сложные в интерпретации, знакомились с принципами статобработки данных. Преподаватели не теряют связь со слушателями курсов и после окончания, следят за их успехами и поддерживают, отметила Елена Земскова.

Доклад Сергея Некрасова, ведущего специалиста по научной поддержке Thermo Fisher Scientific, был посвящен продуктам и решениям для секвенирования нового поколения (NGS) в криминалистике. Это, в частности, полупроводниковое секвенирование, основанное на регистрации высвобождения протонов в момент присоединения очередного нуклеотида к растущей цепи (sequencing by synthesis). «Понятно, что в ближайшее время NGS не заменит капиллярный электрофорез, — пояснил докладчик. — По ряду причин: сложности, стоимости анализа. В настоящий момент до 70% объектов удается отработать по классической схеме, то есть на капиллярном электрофорезе». Скорее NGS будет интегрирован в данную схему, оба метода будут дополнять друг друга. NGS может использоваться для исследования сильно деградированной ДНК, образцов, содержащий смеси ДНК из разных источников, для получения оперативно-розыскной информации и в других специальных случаях.

Секвенирование нового поколения — это чипы с миллионами ячеек, в каждой из которых находится бусина с множеством копий одного фрагмента ДНК, которые служат матрицей для синтеза. Рабочий процесс включает автоматическую подготовку библиотеки и загрузку чипа (Ion Chef), собственно секвенирование (HID Ion GeneStudio) и обработку данных (Converge, Torrent Suite). Существуют наборы для NGS-анализа, ориентированные на задачи криминалистики — анализ мтДНК (всей целиком или так называемого контрольного региона — некодирующего участка, который интересует криминалистов из-за высокой вариабельности), анализ STR, идентификацию личности по SNP, установление биогеографического происхождения человека по аутосомным маркерам. Докладчик подчеркнул, что биогеографический анализ дает самую общую информацию — условно говоря, отличает европейца от жителя Центральной Азии, и, конечно, не может дать информации о конкретном месте проживания. Существует даже панель для фенотипирования — 24 SNP, связанных с внешними признаками, взятые из HIrisPlex. Речь не идет о «портрете по ДНК», но даже самые общие сведения о внешности человека, которому принадлежал образец, могут быть полезны следствию.

«Митохондриальная» панель удобна для исследования неопознанных человеческих останков. Что интересно, используется два пула праймеров, так что получается два набора перекрывающихся ампликонов — это позволяет достоверно читать концы. По мнению Сергея Некрасова, в наше время уже проще получить полный митохондриальный геном, чем контрольный регион, — расход времени будет ненамного больше, а информации существенно прибавится.

Бывают сложные случаи, когда NGS выгоднее использовать для STR-анализа, чем старый добрый электрофорез, — когда важна информация о последовательности, а не только о количестве повторов. Фрагменты одинаковой длины могут различаться по сиквенсу, то есть изучаемые локусы оказываются более полиморфными. Также появляется возможность изучать SNP в областях между повторами и праймером.

Доклад Алексея Вахрушина, менеджера по работе с ключевыми клиентами Thermo Fisher, был посвящен экспресс-идентификации личности по ДНК. Алексей Вахрушин рассказал о деле человека по имени Антони Имела, осужденного в Великобритании за серию изнасилований. Его поведение показалось подозрительным соседу, Имела доставили в полицейский участок, взяли у него образца буккального эпителия (мазок с внутренней стороны щеки) и затем отпустили до получения результата. А три дня спустя Имела похитил и изнасиловал 10-летнюю девочку. Своей жертве он сказал, что «ему больше нечего терять». По результатам анализа он был задержан, но если бы анализ делался быстрее, последнего преступления не произошло бы. «Эти несколько дней могут стать вопросом жизни и смерти», — говорит Алексей Вахрушин; вот почему важно развивать технологии «быстрой ДНК» (Rapid DNA).

Докладчик напомнил аудитории сцену из сериала CSI: Crime Scene Investigation, где герои берут образец крови с места преступления и буквально за 90 секунд на глазах у зрителей получают результаты анализа ДНК в мобильной лаборатории. В реальности все не так, как в кино: образец везут в лабораторию, где он дожидается своей очереди, и вся процедура от взятия образца до результата занимает дни, а не секунды. Система Applied Biosystems Rapid DNA может изменить ситуацию — не будет ни транспортировки; ни очередей, ни ожидания результата. Девяносто секунд на анализ — пока фантастика, но 90 минут — уже реальность. Система состоит из двух компонентов: это сам RapidHIT ID Instrument, который докладчик назвал «айфоном в мире криминалистики», и программное обеспечение RapidLINK. RapidHIT ID — небольшой прибор, в котором происходит все: лизис образца, отделение твердой фракции, ПЦР, электрофорез, анализ и вывод результатов. От оператора не требуется специальных знаний, все необходимое может сделать рядовой работник полиции в полевых условиях. Программное обеспечение позволяет искать в базе данных прямые совпадения и родственные связи, строит родословные деревья, а также автоматически определяет контаминацию генетическим материалом персонала.

Разработчики пока фокусируются на буккальном эпителии, но есть возможность работать и с другими образцами, обычно обнаруживаемыми на месте преступления (об этом подробнее рассказал следующий докладчик) контактными следами и заношенными участками одежды, сигаретными окурками, жевательной резинкой, волосами. По словам Алексея Вахрушина, для анализа может быть достаточно 0,25 мкл крови. Он также отметил, что прибор уже вышел из лабораторий: национальная служба полиции Нидерландов запустила мобильную лабораторию с RapidHIT.

О технологии «быстрой ДНК» говорил и доктор биологических наук Павел Иванов, начальник Специализированного центра молекулярно-генетических экспертиз (РЦСМЭ Минздрава РФ), один из «отцов-основателей» ДНК-идентификации в России. Он сразу предупредил, что намерен не вникать в технические особенности технологии, а сделать обзор ее истории, развития и внедрения, чтобы стало понятнее, куда она идет и какие ниши может занять. Павел Иванов вкратце напомнил о предыстории — технологиях ныне музейных, открытии ДНК-фингерпринта Алеком Джеффрисом (публикация 1985 года) и параллельных российских исследованиях, о появлении капиллярного электрофореза, сменившего традиционный, в пластинах геля, и флуоресцентных меток. (Уже тогда наметилась эта тенденция: все меньше работы руками, все больше делают приборы.) Затем он привел яркие примеры использования метода в криминалистике, от традиционных следов на месте преступления до исследования накладного носа, баночки с массажным кремом и молельного коврика из резиденции Ясира Арафата («богатый материал с точки зрения судебной идентификации, там, где человек касался лбом, — очень хороший объект»).

Идея совместить все этапы исследования ДНК в одном приборе зародилась еще в начале 2000-х годов. «Основная мысль ФБР, которое инициировало эти исследования, была в том, что нужно упростить и ускорить процесс идентификации сообразно юриспруденции Соединенных Штатов. Чтобы это не было дорогим и долгим лабораторным исследованием, а осуществлялось на базе полицейского участка, как это виделось в Америке, — это, конечно, совершенно не то, что видится у нас… Там описано, как это должно происходить: задержать человека, в течение двух часов они его могут держать; взять у него ДНК, проверить по централизованной базе данных — а США были в числе пионеров создания национальных баз данных, первой была Великобритания, а вторыми как раз США. Сейчас там находятся порядка 6-7 миллионов (наборов данных). Если вы спросите, а как у нас, я вам скажу, что у нас две-три сотни тысяч». И по результатам поиска можно будет принять решение, арестовать ли человека или принести извинения и отпустить. Разумеется, процедуру взятия биоматериала надо будет формализовать — без подтверждения, что мазок взят именно у подозреваемого с соблюдением всех правил, быстрый результат будет бесполезен.

Павел Иванов рассказал о своем визите в Университет Аризоны в 2012–2013 году, где разрабатывалась платформа быстрой ДНК; в разработке участвовал Фредерик Зенхаузерн. Прибор создавался для суровых военно-полевых условий, был переносным и удароустойчивым, однако в серию он не пошел. Еще один подобный прибор, DNAscan, Павел Иванов увидел в 2013 году на совещании по быстрой ДНК в Лионе: прибор принадлежал компании General Electric (GE Health Care Life Science), В том же 2013 году появился и Rapid HIT 200; в его демонстрации принял участие Алек Джеффрис, автор метода ДНК-фингерпринта, и сам докладчик тоже решил лично проверить, как это работает. От взятия мазка буккального эпителия до получения STR-профиля всего полтора часа — конечно, это было впечатляющим результатом.

И уже в 2014–2015 гг. этот прибор получили и начали эксплуатировать в РЦСМЭ Минздрава России. Хотя платформа была предназначена для работы с буккальным эпителием, в лаборатории Иванова провели множество экспериментов с различными образцами: исследовали вырезки из пятен крови, окурки, волосы, контактные следы (для пробы однажды генотипировали зарубежного гостя лаборатории — был сделан анализ биоматериала с чашки, из которой он пил кофе!). Результаты были хуже, чем с буккальным эпителием, но это и неудивительно, отметил докладчик: аппаратуру нужно использовать по назначению, для других образцов, по-хорошему, нужны другие картриджи или же новый картридж с повышенной чувствительностью, пригодный для работы с любыми образцами.

То, что можно считать недостатком прибора, — по сути, оборотная сторона его достоинств: вмешательство человека в процесс минимально, простых способов что-то изменить в процедуре не существует. Это удобно для работы в полевых условиях и для неквалифицированных пользователей, и никто не способен повлиять на результат, даже если такое желание почему-либо возникнет, но у профессионалов это может вызывать дискомфорт.

Не вполне привычную для молекулярных биологов тему затронул Андрей Рунов (ВНИИ метрологии им. Д.И. Менделеева), представляющий Рабочую группу по анализу нуклеиновых кислот Консультативного комитета по количеству вещества (аналитическая химия и биология) Международного бюро мер и весов: метрология биологического анализа, и в том числе ДНК-анализа в криминалистике. Как должны осуществляться поверки и калибровки приборов, с какими эталонами соотносить результаты? Традиционная метрология требует верификации измерений по эталонам системы СИ, но как применить это условие к последовательности ДНК? Очевидно, должны быть созданы некие стандартные образцы, чтобы обеспечить сопоставление результатов, полученных в разных лабораториях, и докладчик призвал экспертов не относиться к этой задаче равнодушно: «Вам могут сверху спустить директиву, сказать “стандартные образцы будут такими-то”. Не такими как вы хотите, которые вы могли бы использовать не только для поверки, а еще и в рутинной работе».

Заключительный доклад был посвящен решениям компании Hamilton для автоматизации пробоподготовки в криминалистических лабораториях. «У человека, к сожалению, не стандартизируемы руки», — говорит Сергей Асеев, менеджер компании по России, СНГ и Восточной Европе. Hamilton остается пионером в области высокоточных автоматизированных технологий обработки жидкостей, его решениями пользуется Thermo Fisher, как и другие лидеры отрасли. Автоматизация повышает качество и производительность работы, облегчает стандартизацию, а в случае HID еще и снижает возможность контаминации генетическим материалом сотрудников. Сергей Асеев рассказал о полностью автоматизированной HID лаборатории, о том, какие решения применяются на каждом этапе, от лизирования образца и работы с FTA-картами (Flinders Technology Associates — специальные карты, на которые наносят жидкие биоматериалы и мазки для удобства транспортировки и дальнейшей работы) до ПЦР, электрофореза и подготовки библиотек для секвенирования.