Разработан метод расшифровки ДНК без секвенирования

Для реализации фантастических задумок молекулярных медиков и генных технологов ученым необходимо не только разрабатывать методы точечной доставки лекарственных средств, но и совершенствовать диагностику.

 

Краеугольный камень в решении этих вопросов – последовательность ДНК. Ее нужно расшифровать и найти болезнетворную ошибку в последовательности нуклеотидов. Зная, какая из «букв» генетического текста написана неверно, медики смогут корректировать патогенные последовательности или диагностировать болезни превентивно. То есть на той стадии, когда у человека еще нет никаких клинических признаков.

Секвенирование ДНК

За прошедшие десятилетия исконный метод секвенирования ДНК удалось значительно доработать и модифицировать. Но ученые продолжают разрабатывать технологии, которые позволят считывать генетические последовательности быстро и недорого.

 

Infox.ru уже писал об изобретениях, которые помогут снизить стоимость секвенирования ДНК до $50 000 и $4400 или даже $30. В свежем номере журнала PNAS появилась статья, в которой исследователи из Университета Вашингтона (University of Washington) и Университета Алабамы в Бирмингеме (University of Alabama Birmingham) описывают метод прямого анализа ДНК – без восстановления и реконструкции прежнего облика молекулы.

Без реактивов

Считывать последовательность можно без специальных реагентов, флуоресцирующих белков и кропотливого восстановления прежнего облика ДНК. Для этого необходимо «заманить» одну из цепочек ДНК в нанопору — «пещеру» с лазом не менее 1 нм в диаметре. Подобная органическая или неорганическая «пещера», изменяя интенсивность ионного тока и соответственно напряжение, способна выполнять функции ДНК-томографа. То есть пока последовательность или ее участок пробирается через нанощель, чувствительный вольтметр фиксирует изменение напряжения. Далее по «электрическому портрету» элементарных нуклеотидных оснований (потенциалы которых известны) ученые способны описать молекулярную структуру.

Споры о поре

Этот метод генетического анализа разрабатывается учеными всего мира с 1995 года. И если исследователи более или менее единогласно определились с тем, как «заманить» последовательность нуклеотидов в «ДНК-томограф» (с помощью ферментов или ионного тока), то устройство самого считывающего механизма еще предстоит доработать.

 

Например, профессор Кейс Деккер (Cees Dekker) и его коллеги из Дельфтского технологического университета (Delft University of Technology) предлагают использовать графеновые нанопоры, сконструированные на кремниевой пластинке. А Ян Деррингтон (Ian Derrington) и его коллеги из Университета Вашингтона (University of Washington) считают, что не нужно изобретать велосипед заново. Необходимо доработать уже имеющуюся технологию – протеиновую нанопору.

 

По словам исследователей, секвенатор должен быть именно белковым, а не графеновым или минеральным. «В отличие от неорганических нанопор протеиновая система легко поддается структурной модификации и может быть произведена с субнанометровой точностью», — пишут естествоиспытатели в журнале PNAS.

Белковая пора

В арсенале нанотехнологов уже есть проверенная и запатентованная нанопора, в структуру которой входит хорошо изученный белок – альфа-гемолизин. Этот бактериальный протеин встраивается в клеточную мембрану и дырявит ее, формируя пору. Клетка с продырявленной мембраной теряет контроль над переносом веществ, заболевает и погибает.

 

Изучив свойства вредоносных гемолизинов, ученые общими усилиями приучили белок, заставив его секвенировать нуклеотиды. Однако структура гемолизиновой нанопоры создает некоторые ограничения для эффективного анализа ДНК. Так, из-за большой глубины канала (5 нм) специфичность нуклеотидов, выраженная напряжением ионного тока, уменьшается. То есть сигнал размывается — ученые могут перепутать нуклеотиды.

 

Исследователи решили побороться с этим недостатком и создали новую нанопору на основе протеина непатогенной микобактерии — Mycobacterium smegmatis. Бактериальный мембранный белок MspA порин формирует плотно связанную симметричную октамерную структуру в форме водоворота. В центре белковой воронки образуется канал глубиной всего 2 нм, через который микобактерии и получают гидрофильные соединения.

Исследователи предположили, что MspA порин сможет распознавать нуклеотиды.

 

MspA порин имеет избыточный отрицательный заряд, который также может создавать помехи, поэтому экспериментаторы с помощью генетических манипуляций нейтрализовали носителей избыточного заряда – три основания аспарагиновой кислоты.

 

 

Рис. 1 3D−модель нанопоры в поперечном разрезе

 

 

 

Ученые отмечают, что нанопора на основе MspA — потенциальный кандидат на роль эффективного и экономически выгодного секвенатора.

 

На пространственной модели (рис.1) цветами отмечено распределение зарядов внутри «воронки». Красным и синим цветом обозначены положительно и отрицательно заряженные участки соответственно; сиреневые участки имеют двойной заряд (полярные основания); желтые и оранжевые — гидрофобные основания (парафиновые и ароматические). Сужение диаметром 1,2 нм позволяет пройти сквозь воронку всего лишь одному нуклеотиду.

ДНК-томограф

Мутированный бактериальный белок исследователи поместили в ячейки (диаметр 20 микрон) липидного бислоя, натянутого на тефлоновую пластинку.

Чтобы проверить собственную гипотезу и точность «молекулярного томографа», исследователи синтезировали ДНК с известной последовательностью нуклеотидов и пропустили ее через секвенирующую нанопору.

 

 

Рис. 2 Прохождение цепочки ДНК через нанопору

 

 

Положительно заряженное основание чипа заставляло одинарную цепочку ДНК перемещаться по белковому каналу (a). Двойная спираль ДНК, которая остается на поверхности поры, притормаживает процесс и не позволяет одинарной цепочке проскользнуть через секвенирующую нанопорку слишком быстро (b). В это время датчик фиксирует изменение ионного тока.

 

По результатам эксперимента ученые пришли к выводу, что секвенатор на основе MspA порин способен различать все четыре типа нуклеотидов по изменениям ионного тока.

 

Ознакомиться с результатами эксперимента подробнее можно прочитав статью Nanopore DNA sequencing with MspA.