Нобелевская премия по химии — 2015

Лауреаты Нобелевской премии по химии 2015 года: Томас Линдаль (Tomas Lindahl), Пол Модрич (Paul Modrich) и Азиз Санджар (Aziz Sancar). Фото © Cancer Research UK / K. Wolf / M. Englund

7 октября были объявлены лауреаты Нобелевской премии по химии 2015 года. Ими стали британец шведского происхождения Томас Линдаль (Tomas Lindahl), американец Пол Модрич (Paul L. Modrich) и американец турецкого происхождения Азиз Санджар (Aziz Sancar). Нобелевский комитет отметил вклад этих ученых в исследование механизмов восстановления (репарации) ДНК — важной внутриклеточной системы, нацеленной на поиск и исправление многочисленных повреждений, возникающих при нормальной репликации ДНК в клетке или в результате воздействия физических или химических агентов. Нарушение работы этой системы связано с целым рядом тяжелых наследственных болезней, да и вообще, без нее сложные формы жизни вряд ли бы могли существовать.

Как всё начиналось

Когда закончилась Вторая мировая война, люди разных профессий по-разному подводили ее итоги. Политики перекраивали карту мира, генералы — перестраивали тактику и стратегию с новыми видами оружия... Были свои итоги и у врачей. Война показала волшебную силу лекарств нового типа — антибиотиков, которые, начиная с 1944 года, спасли жизнь десяткам тысяч раненых.

Поэтому вскоре после окончания войны молодой микробиолог Альберт Кельнер, работавший в лаборатории Колд-Спринг-Харбор, тогда еще не ставшей Меккой молекулярной биологии, занялся модной в то время темой, сулящей при удаче большой коммерческий успех, — поиском мутантных форм бактерий и микроскопических грибков, которые могли бы производить новые антибиотики или хотя бы большие количества уже известных антибиотиков. Кельнер решил облучать культуры стрептомицетов ультрафиолетовым светом, мутагенные свойства которого были известны уже тогда. Но дела не заладились с самого начала: эксперименты плохо воспроизводились. Одни облученные культуры росли хорошо, другие плохо, и закономерности в этом не наблюдалось никакой.

Если бы Альберт Кельнер был не таким аккуратным ученым и не записывал все детали своих экспериментов, возможно, он забросил бы свой проект, и Нобелевская премия по химии 2015 года была бы вручена за совершенно другие работы. Однако, тщательно проанализировав всё, что могло пойти не так, Кельнер сделал верный вывод. После облучения он растил культуры бактерий в стеклянных колбах, погруженных в стеклянную же водяную баню. В тех колбах, которые были обращены в сторону окна, бактерии выживали после ультрафиолета лучше, а в тех, которые были затенены, — хуже.

Кельнер догадался, что солнечный свет каким-то образом запускает в бактериях процесс, который помогает им исправить повреждения, нанесенные ультрафиолетом. Это явление вскоре назвали фотореактивацией, и она стала первым известным биологам видом репарации ДНК. Один из нынешних лауреатов, Азиз Санджар, в свои аспирантские годы поставил очень эффектный эксперимент, показывающий всю мощь системы фотореактивации: он облучал бактерии на чашках Петри ультрафиолетом в смертельной дозе, так, что выживало менее одной клетки из 10 миллионов, а потом светил на них фотовспышкой. Света продолжительностью 1 миллисекунду хватало, чтобы число выживших бактерий увеличилось в сто тысяч раз!

Увы, до наших дней Альберт Кельнер не дожил и даже не получил заслуженной известности — в наше время достаточно сказать, что статьи о нем нет в Википедии. Независимо от Кельнера и буквально на несколько недель позже фотореактивацию обнаружил Ренатто Дульбекко — знаменитый итальянско-американский вирусолог, который позже получил Нобелевскую премию, но не за открытие репарации, а за работы с онковирусами. Интересно, что Кельнер написал Дульбекко о своем открытии, но тот получил письмо как раз тогда, когда заканчивал опыты по выживанию облученных ультрафиолетом бактериофагов — с теми же результатами и выводами, что и у Кельнера.

Именно поэтому формулировка нынешней премии — «за исследование механизмов репарации ДНК», а не «за открытие репарации ДНК». Первооткрывателей в живых не осталось, да и вообще в этой области не было фигур, про которых можно было бы сказать, что они ее заложили. Лауреаты 2015 года внесли огромный вклад в изучение репарации ДНК, но наряду с ними работали и другие, не менее великие ученые. Среди исследователей, занимающихся репарацией ДНК, даже бытовало мнение, что Нобелевской премии за нее не дадут — настолько трудно выбрать лауреатов среди многих достойных.

Но прежде чем говорить об исследованиях Томаса Линдаля, Пола Модрича и Азиза Санджара, стоит сказать несколько слов о репарации ДНК в целом. На самом деле, это даже не один механизм, а как минимум шесть разных — а в зависимости от того, что принимать за репарацию, можно насчитать и восемь.

Курить вредно, дышать вредно, жить вредно

Говорят, что каждая минута приближает нас к смерти. С точки зрения биохимика это не просто тривиальная фраза. ДНК всех живых организмов постоянно подвергается воздействию повреждающих факторов. Какие-то из них приходят извне — тот же ультрафиолет, радиация, тысячи химически активных веществ в нашей пище (знаете ли вы, что чашка кофе содержит несколько сотен соединений, которые в больших дозах мутагенны?).

Но гораздо важнее факторы внутренние, которых мы не можем избежать в принципе. Главных таких факторов три. Во-первых, весь наш обмен веществ основан на кислородном дыхании. Митохондрии — клеточные органеллы, в которых кислород используется для производства АТФ, «энергетической валюты» наших клеток, — работают не с абсолютной эффективностью, и промежуточные активные формы кислорода утекают из них и способны повреждать ДНК. Во-вторых, как известно, мы в среднем на 60% состоим из воды, которая, в общем, тоже очень активное соединение и постоянно гидролизует ДНК. Наконец, еще одним важным источником повреждений в ДНК служат ошибки ферментов, которые ее копируют, — ДНК-полимераз; количество неверно включенных нуклеотидов составляет около 300 000 на каждое клеточное деление.

Наглядно представить себе масштаб проблемы позволяет несложный пересчет. Если вообразить ДНК одной человеческой клетки в виде Транссибирской магистрали и свести вместе оценочные величины для всех известных видов повреждений, то получится, что количество повреждений, возникающих каждый день в ДНК каждой клетки человека, соответствует одной поломке на каждые 100 метров Транссиба. Не каждый организм был бы способен выжить при такой нагрузке.

В том, что мы до сих пор живы, заслуга репарации ДНК. Как уже говорилось, насчитывается шесть основных ее механизмов, и к четырем из них нынешние лауреаты имеют непосредственное отношение.

Репарация. Самый простой способ

Вернемся для начала к фотореактивации. Это один из частных примеров механизма реактивации, или прямого восстановления, при котором поврежденное звено ДНК превращается в нормальное без каких-то промежуточных шагов. В случае фотореактивации происходит вот что. Под влиянием ультрафиолетового света соседние основания тимина в ДНК могут сшиваться друг с другом и образовывать так называемые циклобутановые пиримидиновые димеры, которые очень сильно искажают структуру ДНК и не дают возможности ДНК-полимеразам копировать поврежденный участок. Бактерии же содержат фермент фотолиазу, который использует энергию видимого света для того, чтобы расщепить связи между основаниями в димере, превращая его опять в два тимина (рис. 1).

Рис. 1. Реакция, катализируемая фотолиазой. Фотон с длиной волны, соответствующей синему цвету, поглощается ферментом, и его энергия (hν) используется для расщепления тиминового димера на отдельные тимины

С исследования фотолиазы началась карьера Азиза Санджара. Нет, он не открыл ее — это сделал еще в конце 1950-х годов Стэн Руперт (Claud S. (Stan) Rupert), в лабораторию которого спустя полтора десятка лет приехал молодой выпускник Стамбульского университета. Санджар впервые клонировал фотолиазу, то есть выделил кодирующий ее ген, а потом произвел генно-инженерный белок. Природной фотолиазы в бактериях очень мало, и работа эта стала переломной для исследования фотореактивации — теперь можно было производить белок в больших количествах и изучать его всесторонне, чем Санджар активно и долго занимался. Химики часто протестуют, когда премии в области химии дают биологам. Но надо сказать, что фотолиаза представляет собой прекрасный пример сложной химической системы, осуществляющей фотокатализ: путь энергии, принесенной фотоном, поглощенным 5,10-метенилтетрагидроптероилполиглутаматом — хромофором в составе белка — через второй хромофор (флавинадениндинуклеотид) к циклобутановому пиримидиновому димеру сейчас прослежен вплоть до квантовомеханического описания.

Вырезать и заменить

Достаточно ли этого для получения Нобелевской премии? Кто знает. Но Азиз Санджар не ограничился фотолиазой и занялся еще и другим малопонятным на тот момент явлением, которое тогда называли «темновой репарацией». На самом деле бактерии, облученные ультрафиолетом, способны исправлять внесенные повреждения не только на свету — просто для этого нужно гораздо больше времени. Фотолиаза тут почти ни при чем («почти» — потому что, как выяснилось гораздо позже, она помогает темновой репарации, но без нее вполне можно обойтись), работают другие ферменты.

К тому времени было известно, что в темноте тиминовые димеры постепенно исчезают из ДНК (это открытие сделал в начале 1960-х годов Ричард Сетлоу (Richard B. Setlow), который вполне мог бы претендовать на премию, если бы не умер в апреле этого года) и что после облучения ультрафиолетом в клетках начинается синтез ДНК (автор этого открытия Филип Ханаволт (Philip Hanawalt) еще жив и в свои 84 года активно работает, но премия его обошла). Были известны три гена, которые отвечали за темновую репарацию, их назвали uvrA, uvrB и uvrC (uvr — от английского «UV-resistant», устойчивый к ультрафиолету), но оставалось совершенно непонятно, как же всё это в клетке происходит. Опять же, в основном проблемы были в том, что белков этих в клетке очень мало, и исследовать их из-за этого очень трудно.

Санджар, занявшись этим вопросом, для начала изобрел совершенно фантастический метод бактериальных «макси-клеток», который позволял получать огромный избыток нужного продукта при минимальном загрязнении другими клеточными белками. На рубеже 1970–80-х годов им пользовались десятки лабораторий для идентификации самых разных белков, а сам изобретатель с его помощью быстро охарактеризовал белковые продукты генов uvrA, uvrB и uvrC и показал, что они образуют комплекс, который назвали эксцинуклеазой (Excinuclease) — он был способен вырезать (англ. excise) кусок ДНК размером 13 пар нуклеотидов вокруг тиминового димера. От этого весь механизм получил название эксцизионной репарации нуклеотидов (Nucleotide excision repair, NER; рис. 2). Дальнейшие исследования позволили установить, что после вырезания фрагмента, содержащего повреждение, ДНК-полимераза синтезирует нормальный участок цепи ДНК, и процесс репарации завершается ферментом ДНК-лигазой, которая восстанавливает целостность остова ДНК.

Рис. 2. Эксцизионная репарация нуклеотидов. Эксцинуклеаза UvrABC вырезает короткий участок ДНК вокруг повреждения, геликаза UvrD его вытесняет, и образовавшаяся брешь застраивается ДНК-полимеразой

Как выяснилось впоследствии, эксцизионная репарация нуклеотидов для жизни в целом гораздо важнее, чем фотореактивация. Например, у человека фотолиазы нет — из всех млекопитающих ее сохранили только сумчатые, а у остальных сохранились гомологи фотолиазы, криптохромы, отвечающие за суточные ритмы (и тоже открытые Санджаром). Поэтому вся репарация вызванных ультрафиолетовым светом повреждений у нас опирается исключительно на эксцизионную репарацию нуклеотидов. Правда, белки этой системы у нас совсем не похожи на бактериальные, но принцип работы тот же — вырезать отрезок ДНК и заменить его новым. Дефекты эксцизионной репарации нуклеотидов вызывают тяжелейшее наследственное заболевание — пигментную ксеродерму, при которой малейшее пребывание на солнце приводит к ожогам, и за несколько лет жизни развивается рак кожи. Да что там кожи: для пигментной ксеродермы очень характерен рак кончика языка — человек на свету облизывает пересохшие губы, и этих нескольких секунд облучения достаточно, чтобы в ДНК возникло столько повреждений, что они в отсутствие репарации вызывают мутации и рак. Еще более важно то, что фотореактивация — процесс специфичный только для тиминовых димеров, другие повреждения ею не исправляются, а вот эксцизионная репарация нуклеотидов универсальна и помогает бороться с огромным числом самых разнообразных повреждений ДНК, например с теми, что вызываются канцерогенами в табачном дыме.

Воздав такую хвалу эксцизионной репарации нуклеотидов, нужно сразу отметить, что исправляет она от силы 10% всех повреждений, возникающих в нашей ДНК. Остальное находится в ведении систем, открытых двумя другими лауреатами. Принцип действия у них также основан на удалении поврежденной части ДНК и ее повторном синтезе, но вот механизмы отличаются довольно сильно.

Что делать, если не стыкуется

Сначала поговорим о мисматч-репарации (DNA mismatch repair). Ей не повезло даже с названием: терминология в этой области складывалась в конце 1980-х, когда в России с наукой было не всё в порядке, поэтому общепринятого термина не существует — кто-то просто копирует английское mismatch repair (слово mismatch в английском языке обозначает неправильную, неподходящую пару, мезальянс), кто-то использует названия «репарация гетеродуплексов», «репарация неканонических пар оснований»... В любом случае, это система, которая исправляет ошибки ДНК-полимераз, если те включают в ДНК при синтезе не те нуклеотиды, что нужно, — образуют не пары A:T и G:C, а что-то другое, например G:T. Такое случается редко, но всё же случается, потому что ни один фермент не работает со стопроцентной точностью.

Главная проблема при исправлении таких ошибок ДНК-полимераз — не то, как удалить неправильно включенный нуклеотид, а как узнать, что он неправильно включен. В самом деле, до этого мы говорили о поврежденных звеньях ДНК — их структура отличается от нормальной, и их каким-то образом можно распознать. А как быть в случае, когда оба нуклеотида нормальные, но друг другу не соответствуют? Какой из них был в исходной ДНК, в материнской цепи, а какой был неверно включен в дочернюю цепь?

Многие бактерии решают эту проблему, маркируя материнскую цепь при помощи метильных групп, которые специальный фермент, ДНК-метилаза Dam, вводит в основания аденина, находящиеся в последовательностях -GATC-. Таким образом, сразу после синтеза ДНК эта последовательность на протяжении нескольких минут остается полуметилированной — то есть несет метильные группы в материнской цепи и не содержит их во вновь синтезированной дочерней цепи. Этого времени системе мисматч-репарации достаточно для того, чтобы сработать. У человека механизм, различающий материнскую и дочернюю цепь, другой и более сложный, основанный на асимметричном связывании некоторых белков при репликации, — но он всё равно существует, мисматч-репарация без такого механизма работать не может.

Как именно развиваются события после маркировки цепей метильными группами — вот главный вклад Пола Модрича в исследования репарации ДНК. К тому времени, когда Модрич начал работать в этой области, ситуация напоминала ту, в которой оказался Санджар: были известны гены, которые необходимы для репарации (mutH, mutL и mutS), было понятно, что различение материнской и дочерней цепей основано на метилировании, но никто понятия не имел, что и как делает каждый белок в этом пути. Модрич придумал элегантную систему, основанную на образовании дуплексов между цепочками ДНК бактериофагов, отличающихся на один нуклеотид, что позволило ему проследить судьбу неправильных пар нуклеотидов в деталях — и с изолированными белками системы репарации, и в клетках бактерий. Как оказалось, процесс начинается с того, что сразу после репликации с полуметилированными последовательностями -GATC- связывается белок MutH. Одновременно с неправильной парой нуклеотидов связываются две молекулы белка MutS. Забавно, что, когда ученые в 2000 году определили структуру MutS, две молекулы белка оказались очень похожими на сложенные в молитве ладони, между которыми зажата ДНК. Когда расстояние между MutH и димером MutS позволяет им взаимодействовать (в чем им помогает третий член системы, MutL), белок MutH превращается в эндонуклеазу, которая расщепляет неметилированную цепь в последовательности -GATC-. Начиная с этого разрыва дочерняя цепь ДНК затем удаляется в направлении связанного белка MutS. Достигнув неправильной пары оснований, разрушение ДНК останавливается, после чего недостающий участок ДНК вновь синтезируется.

Рис. 3. Мисматч-репарация. Димер белка MutS узнает неправильную пару нуклеотидов, а белок MutH – полуметилированный участок -GATC-. Затем MutH вносит разрыв в неметилированную цепь, которая считается дочерней, и участок ДНК вплоть до неправильной пары удаляется и синтезируется вновь

В лаборатории Пола Модрича были открыты основные принципы мисматч-репарации и у бактерий, и у человека. Система мисматч-репарации у нас очень похожа на бактериальную, за исключением принципа определения материнской и дочерней цепи. Мутации в генах, ответственных за мисматч-репарацию, приводят к развитию наследственного рака кишечника и служат самой распространенной причиной этого заболевания.

Самая важная система

Обратимся, наконец, к третьей главной системе репарации — эксцизионной репарации оснований. Вообще-то, ее следовало бы назвать первой, по крайней мере по значению, ибо она устраняет подавляющее большинство всех повреждений. К ним относятся как раз те, которые неизбежно возникают в ДНК под действием воды и кислорода, но и многие другие повреждения тоже ею исправляются. Если поломки в других системах репарации вызывают тяжкие болезни, неисправность эксцизионной репарации оснований у человека, за редкими исключениями, в заболеваниях не проявляется — такие дети просто не рождаются, эмбрионы гибнут на самых ранних стадиях.

Наверное, в эксцизионной репарации оснований самое интересное то, что она была открыта, что называется, «на кончике пера». Как когда-то французский астроном Урбен Леверье задумался над возмущениями орбиты Урана и открыл Нептун, так в начале 1970-х годов Томас Линдаль задумался над химической реактивностью ДНК и открыл новый механизм ее репарации. Сам Линдаль утверждает, что его вдохновила знаменитая «Белая книга» — переведенная на английский язык монография «Органическая химия нуклеиновых кислот» академика Н. К. Кочеткова с соавторами, ставшая настольной книгой во многих биохимических лабораториях мира. Прочитав ее, биолог Линдаль понял, что представление о ДНК, как химически устойчивой молекуле, которая лишь изредка повреждается под влиянием ультрафиолета, радиации или химических мутагенов, в корне неверно — ДНК в водной среде повреждается постоянно. Выбрав две простых и легко идущих химических реакции — превращение цитозина в урацил (который в норме встречается в РНК, но не в ДНК) и апуринизацию (отщепление от ДНК аденина или гуанина), — Линдаль быстро показал, что они протекают и в изолированной ДНК, и в живой клетке. Более того, получив ДНК, в которой часть цитозина была заменена на урацил, он обнаружил и фермент, который удалял урацил в виде свободного основания — урацил-ДНК-гликозилазу (Uracil DNA glycosylases) — и новый вид репарации был открыт.

По пути эксцизионной репарации оснований происходит репарация небольших поврежденных оснований и апуринизированных нуклеотидов, которые не вносят значительных искажений в структуру ДНК и поэтому не узнаются системой эксцизионной репарации нуклеотидов. Сначала поврежденное основание узнается одним из ферментов, относящимся к классу ДНК-гликозилаз (DNA glycosylase), которые выщепляют его из ДНК. ДНК-гликозилазы обладают групповой специфичностью — некоторые удаляют из ДНК только окисленные пуриновые основания, другие — окисленные пиримидины, третьи — алкилированные основания, четвертые — урацил и т. п. После этого фермент АП-эндонуклеаза разрывает ДНК рядом с повреждением, ДНК-полимераза встраивает один (так называемая «короткозаплаточная репарация») или несколько нуклеотидов («длиннозаплаточная репарация»), и репарация завершается ДНК-лигазой. В процессе эксцизионной репарации оснований участвуют еще несколько белков, но они играют вспомогательную роль.

Рис. 4. Эксцизионная репарация оснований. ДНК-гликозилаза вырезает поврежденное основание, затем АП-эндонуклеаза разрывает поврежденную цепь ДНК, а далее в зависимости от участвующей ДНК-полимеразы вытесняются один или несколько нуклеотидов поврежденной цепи с одновременным синтезом нового участка ДНК

В последние годы выяснилось, что природа, которая любит использовать готовые решения, приспособила эксцизионную репарацию оснований не только для ремонта ДНК, но и для, казалось бы, совсем посторонних вещей. Например, ту же урацил-ДНК-гликозилазу клетки человека используют для борьбы с вирусами, в частности с ВИЧ. Существует специальный фермент APOBEC, который в вирусной ДНК массово превращает цитозин в урацил, а урацил-ДНК-гликозилаза потом такую ДНК расщепляет. Иммунный ответ также требует участия урацил-ДНК-гликозилазы, которая в этом случае отвечает за генерацию разнообразия антител. Эксцизионная репарация оснований лежит в основе эпигенетических процессов — направленной модификации ДНК, которая регулирует активность генов. В раковых клетках некоторые пути репарации выключены — и ингибиторы оставшихся путей, главным образом эксцизионной репарацию оснований, сейчас рассматриваются как новые многообещающие лекарства в онкологии.

Помимо множества собственных открытий, Томас Линдаль сослужил огромную службу науке и тем, что воспитал многих учеников. Через его лабораторию в лондонском Клэр-Холле (Clare Hall laboratories) прошла чуть ли не половина современных лидеров в области репарации ДНК. В июне этого года в честь Линдаля была организована конференция, на которую многие из них съехались со всего мира, и научный уровень ее был, наверное, самым высоким, который только доводилось видеть автору этих строк.

За рамками премии

Неправильно было бы умолчать о том, что репарация ДНК — одно из направлений, в котором российские ученые могут и сейчас достойно поспорить с мировыми классиками. Впрочем, сейчас слово «поспорить» здесь неуместно: исторически сложилось так, что репарация — это такая область, в которой жесткая конкуренция непопулярна, напротив — ведущие лаборатории тесно сотрудничают. В России основные исследования репарации ДНК ведутся в нескольких лабораториях Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в Новосибирске; есть группы, работающие в этом направлении в МГУ, Институте молекулярной генетики РАН, Институте цитологии РАН в Санкт-Петербурге, Петербургском институте ядерной физики.

Репарация ДНК не ограничивается теми путями, которые описаны в этой заметке. Есть еще и рекомбинационная репарация (Homologous recombination), когда для восстановления правильной последовательности ДНК используется ее копия с другой хромосомы, и воссоединение негомологичных концов (Microhomology-mediated end joining), когда часть ДНК теряется, но это часто неважно, потому что она приходится на некодирующие области. Оба этих вида репарации используются, когда нужно исправить двуцепочечный разрыв ДНК. Есть системы толерантности к повреждению (Translesion synthesis), когда клетка может функционировать и даже делиться, несмотря на то, что с ее геномом не всё в порядке. Есть клеточные системы ответа на повреждение (DNA damage response), которые определяют, что клетке делать, если ее ДНК повреждена, — делиться, остановить деление и попытаться отрепарировать повреждение, умереть... Кстати, за исследование последней системы в этом году американцы Стефан Эллидж (Stephen Elledge) и Эвелин Виткин (Evelyn M. Witkin) получили Ласкеровскую премию (Lasker Award) — вторую по престижности в биомедицине; зачастую она служит «предвестником» Нобелевской. Но 94-летняя Эвелин Виткин, которая открыла первую систему координированного клеточного ответа на повреждение ДНК — SOS-ответ — заветной медали вряд ли дождется. Зря Нобель завещал делить премию не более чем на троих; достойных кандидатов гораздо больше.

Источники:
1) Tomas Lindahl. New class of enzymes acting on damaged DNA // Nature. 1976. V. 259. P. 64–66.
2) Tomas Lindahl. Instability and decay of the primary structure of DNA // Nature. 1993. V. 362. P. 709–715.
3) A.-Lien Lu, Susanna Clark, and Paul Modrich. Methyl-directed repair of DNA base pair mismatches in vitro // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1983. V. 80. P. 4639–4643.
4) Paul Modrich. Mechanisms and biological effects of mismatch repair // Annu. Rev. Genet. 1991. V. 25. P. 229–253.
5) Aziz Sancar, W. Dean Rupp. A novel repair enzyme: UVRABC excision nuclease of Escherichia coli cuts a DNA strand on both sides of the damaged region // Cell. 1983. V. 33. P. 249–260.
6) Aziz Sancar. Structure and function of DNA photolyase // Biochemistry. 1994. V. 33. P. 2–9.

Дмитрий Жарков