В долгосрочном эксперименте зафиксировано поэтапное формирование эволюционного новшества

Рис. 1. Эволюционная история популяции Ara-3, в которой бактерии научились питаться цитратом. Числа слева — поколения. Кружками на дереве обозначены 29 клонов, чьи геномы были отсеквенированы. Разноцветными областями выделены пять основных клад (эволюционных линий): UC («unsuccessful clade», быстро вымершая ранняя линия), Clade 1, Clade 2, Clade 3 («потенцированные» клады с повышенной вероятностью появления фенотипа Cit+, то есть способности питаться цитратом), New Cit+ clade — клада, способная питаться цитратом, произошедшая от клады 3 после 31 000 поколений (Cit+ evolves). После 33 000 поколений у бактерий Cit+ появилась мутация, резко повышающая темп мутагенеза (Mutator evolves). В верхней части рисунка показаны результаты повторных эволюционных экспериментов (replays) с замороженными представителями клад 1, 2 и 3. Представители клады 1 выработали фенотип Cit+ в двух случаях из 55 попыток, клады 2 — в двух случаях из 97, клады 3 — в восьми случаях из 37. Представители исходного предкового штамма имеют пренебрежимо малую вероятность появления фенотипа Cit+. График справа внизу показывает темп накопления мутаций, резко увеличившийся у бактерий Cit+ (красные кружки) после появления фенотипа mutator. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

В ходе долгосрочного эволюционного эксперимента на бактериях E. coli в одной из 12 подопытных популяций после 31 000 поколений появился новый полезный признак — способность питаться цитратом в аэробных условиях. Как выяснилось, формирование эволюционного новшества проходило в три этапа. На первом этапе («потенцирование») зафиксировались мутации, помогающие утилизировать цитрат, если он окажется в клетке. Повторные эксперименты с размороженными представителями предковых поколений показали, что потенцирующих мутаций было как минимум две: одна появилась после 15 000 поколений, другая после 20 000. На втором этапе («актуализация») изменилась регуляция гена citT, ответственного за поглощение цитрата из внешней среды. В результате ген стал работать в присутствии кислорода, хотя в норме у E. coli он работает только в анаэробных условиях. Это привело к появлению слабо выраженной, «зачаточной» способности использовать в пищу цитрат. Наконец, на этапе «совершенствования» новая функция была многократно усилена благодаря нескольким дупликациям (удвоениям) фрагмента хромосомы, несущего активированный ген citT. Только после этого численность бактерий-мутантов увеличилась и они стали доминировать в своей популяции. Вероятно, такое поэтапное развитие характерно и для других эволюционных новшеств.

«Элементы» уже рассказывали о долгосрочном эволюционном эксперименте, начатом в 1988 году международной группой исследователей под руководством Ричарда Ленски (Richard E. Lenski) — см.: Подведены итоги эволюционного эксперимента длиной в 40 000 поколений, «Элементы», 02.11.2009; В долгосрочном эволюционном эксперименте выявлен отбор на «эволюционную перспективность», «Элементы», 25.03.2011.

12 подопытных популяций кишечной палочки (E. coli) живут в аэробных условиях в жидкой прозрачной среде, где единственной пищей является глюкоза. С интервалом в сутки из каждой популяции берут небольшую часть и пересаживают в новую колбу с питательной средой. Там бактерии быстро размножаются, пока не исчерпают запасы глюкозы. Таким образом, в течение каждого суточного цикла начальный период изобилия, когда численность популяции быстро растет (численность оценивают по мутности среды), сменяется периодом голода, когда бактерии перестают размножаться и их численность стабилизируется.

По прошествии 31 000 поколений в одной из 12 популяций (ее условное обозначение — Ara-3) произошло нечто странное. Ее численность теперь продолжала расти и после того, как вся глюкоза в колбе была съедена. К концу суточного цикла численность популяции Ara-3 оказывалась намного выше, чем у остальных популяций. Очевидно, микробы научились использовать в пищу какое-то вещество, входящее в состав среды, но несъедобное для обычных кишечных палочек.

Вскоре Ленски и его коллеги выяснили, что бактерии из популяции Ara-3 приобрели способность питаться цитратом (лимонной кислотой). Цитрат добавляется в среду в качестве вспомогательного вещества (хелатирующего агента). Нормальные бактерии E. coli способны усваивать цитрат только в анаэробных условиях. Неспособность питаться цитратом в присутствии кислорода — один из определительных признаков данного вида бактерий. Таким образом, в популяции Ara-3 появилось настоящее «эволюционное новшество» — новый полезный признак (авторы обозначили его Cit⁺), изменивший взаимоотношения организма со средой и позволивший бактериям-мутантам увеличить свою численность и стать доминирующими в популяции. Любопытно, что бактерии Cit⁺ так и не вытеснили до конца бактерий Cit^–, которые питаются только глюкозой. Возможно, их длительное мирное сосуществование объясняется разделением ниш, но это пока лишь гипотеза.

Дизайн долгосрочного эксперимента позволяет проследить формирование эволюционного новшества во всех генетических подробностях. Именно для решения подобных задач эксперимент и был поставлен. Часть представителей каждой популяции периодически замораживают. Это нисколько не вредит здоровью микробов. В любой момент можно их оттаять и использовать для повторных опытов. Это, в частности, позволяет оценить вероятность того или иного эволюционного события: насколько оно было случайным или закономерным.

Авторы отсеквенировали геномы 29 бактерий из популяции Ara-3, замороженных в разное время. Это позволило построить эволюционное дерево, показанное на рис. 1. Оказалось, что популяция оставалась генетически разнообразной на протяжении почти всей своей истории. В результате мутаций и отбора из одного предкового клона получилось несколько генетически различающихся линий (клад), но они не спешили вытеснять друг друга. Скорее всего, это значит, что большинство генетических различий между кладами были нейтральными, то есть не влияли на приспособленность (а в некоторых случаях, как уже говорилось, могло идти взаимное приспособление и раздел ниш).

Исследователи выявили конкретное генетическое изменение, которое дало бактериям возможность питаться цитратом. Микробы Cit^– превратились в Cit⁺ благодаря дупликации (удвоению) фрагмента хромосомы, содержащего ген citT (рис. 2). Этот ген кодирует белок, транспортирующий цитрат из внешней среды в цитоплазму бактериальной клетки. В норме у E. coli ген citT активен только в анаэробных условиях. Однако в результате дупликации одна из двух копий citT попала под управление промотора другого, соседнего гена (rnk). При помощи генно-инженерных экспериментов авторы показали, что промотор гена rnk обеспечивает работу контролируемого им гена в аэробных условиях.

Рис. 2. Тандемная дупликация, которая привела к появлению способности питаться цитратом у бактерий из популяции Ara-3. а — участок хромосомы предкового штамма, b — тот же участок после дупликации. Стрелками и петельками обозначены промоторы генов rna и rnk, обеспечивающие работу этих генов в аэробных условиях. В результате дупликации ген citT, кодирующий транспортер цитрата, оказался под управлением промотора гена rnk и стал экспрессироваться в присутствии кислорода. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Разобравшись с природой ключевой мутации, авторы задались следующим вопросом: было ли появление фенотипа Cit⁺ в кладе 3 популяции Ara-3 полностью случайным? Могло ли это событие с тем же успехом произойти в другой кладе или в другой популяции, или оно было подготовлено предшествующей эволюцией именно этой клады? В поисках ответа авторы провели повторные эволюционные эксперименты с размороженными представителями клад 1, 2 и 3, а также с исходным (предковым) штаммом.

Выяснилось, что у предкового штамма вероятность появления фенотипа Cit⁺ пренебрежимо мала. Представители клады 1 выработали этот фенотип в двух повторных экспериментах из 55. Микробы из клады 2 научились питаться цитратом в двух случаях из 97. Наконец, бактерии из клады 3 приобрели эту способность в восьми случаях из 37 повторных опытов.

Приобретение фенотипа Cit⁺ во всех случаях было связано с тем, что ген citT начинал экспрессироваться в аэробных условиях. Но достигался этот результат разными путями. В части повторных опытов, как и в основном долгосрочном эксперименте, произошли тандемные дупликации, благодаря которым citT оказался под управлением аэробного промотора. Но границы дуплицированных участков в разных случаях были разными, а промотор, взявший на себя управление геном citT, не всегда был промотором гена rnk: в одном случае это был промотор гена rna. В нескольких повторных опытах тот же эффект был достигнут без дупликации — благодаря встраиванию мобильного генетического элемента IS3 в кодирующую часть гена citG, расположенного по соседству с citT (на рисунке слева). В этом мобильном элементе как раз имеется подходящий промотор.

Повторные эксперименты показали, что вероятность приобретения полезного признака Cit⁺ постепенно росла в ряду «предковый штамм — клады 1 и 2 — клада 3». Стало быть, появление данного признака именно в кладе 3 не было простой случайностью. Микробы были заранее подготовлены к этому — «потенцированы». Иными словами, у них в ходе предшествующей эволюции зафиксировались какие-то мутации, которые сами по себе не давали возможности питаться цитратом, но повысили вероятность развития этой способности в будущем. Разумеется, «потенцирующие» мутации зафиксировались не потому, что микробы планируют свою эволюцию наперед. Эти мутации либо были нейтральными и зафиксировались случайно, либо были полезны для чего-то другого. Подготовка к приобретению способности питаться цитратом была побочным эффектом, которого естественный отбор не мог предусмотреть.

Какие именно мутации, характерные для клады 3, сыграли роль «потенцирующих», установить пока не удалось. Хорошим кандидатом является мутация в гене arcB, потому что повреждение этого гена активирует цикл трикарбоновых кислот — биохимический путь, позволяющий клетке эффективно утилизировать цитрат (если клетка вдруг сумеет его где-то раздобыть в больших количествах). Может быть, повреждение гена arcB превратило мутации, активирующие транспорт цитрата в клетку, из нейтральных или вредных в полезные? Предположение выглядит правдоподобным, но авторы пока не сумели подтвердить его экспериментально.

Однако им удалось подтвердить, что какие-то генетические особенности клады 3 действительно делают умение поглощать цитрат из внешней среды более полезным. Чтобы убедиться в этом, они вставляли в представителей предкового штамма и клад 1–3 по несколько копий гена citT под управлением аэробного промотора. Иными словами, они придавали микробам способность поглощать цитрат из внешней среды — и смотрели, пойдет ли эта способность им на пользу.

Представители всех генно-модифицированных штаммов приобрели способность подкармливаться цитратом, но в очень разной степени. Микробы из клады 3 делали это лучше всех: они быстро переключались с глюкозы на цитрат и хорошо росли на чистом цитрате. Микробы из клад 2 и 1 справлялись гораздо хуже: им требовалось больше времени на переключение, и росли на цитрате они медленнее. Предковый штамм использовал цитрат еще менее эффективно. Для того, чтобы после исчерпания запасов глюкозы переключиться на питание цитратом, ему требовалось около двух суток. Между прочим, это означает, что в условиях долгосрочного эксперимента он не получил бы никакого преимущества от мутации, которая создала фенотип Cit⁺ в кладе 3: никто не дал бы ему двух суток на раздумья, ведь бактерий пересаживали в новую среду с глюкозой каждые сутки.

Эти результаты, как и статистика повторных эволюционных экспериментов, показывают, что «потенцирование» проходило как минимум в два этапа. Вероятность формирования фенотипа Cit⁺ выросла при переходе от предкового штамма к кладам 1 и 2 и снова увеличилась при формировании клады 3.

Интересно, что первые представители популяции Ara-3, у которых после поколения №31 000 был зарегистрирован фенотип Cit⁺, использовали цитрат еще очень неэффективно, хотя у них уже были и «потенцирующие» мутации, и тандемная дупликация, показанная на рис. 2b. Новая функция поначалу была крайне несовершенна и давала лишь едва заметное преимущество. В ходе дальнейшей эволюции эффективность использования цитрата микробами Cit⁺ быстро росла. Авторам удалось расшифровать один из механизмов усовершенствования: фрагмент ДНК с активированным геном citT просто-напросто подвергся еще нескольким дупликациям. Это, по-видимому, ускорило поглощение цитрата из внешней среды.

Таким образом, формирование эволюционного новшества происходило в три этапа. На первом этапе (потенцирование, potentiation) закрепились мутации, повысившие вероятность появления признака в будущем. На втором этапе (актуализация, actualization) появилась и была поддержана отбором ключевая мутация, превратившая микробов Cit^– в Cit⁺. Правда, поначалу новый признак был слабо выражен и почти не приносил пользы. На заключительном, третьем этапе (усовершенствование, refinement) признак постепенно оптимизировался. В результате его полезность многократно выросла.

Усовершенствование — процесс, который может продолжаться долго. Однако события, происходившие в популяции Ara-3 после поколения №35 000, трудно анализировать. В это время среди микробов Cit⁺ распространилась мутация, повышающая скорость мутагенеза примерно в 20 раз (фенотип mutator). Такие «мутаторы» появились не только в Ara-3, но и в нескольких других популяциях. Найти среди сотен новых мутаций те, что связаны с усовершенствованием цитратного питания, — задача пока слишком трудная. Впрочем, замороженные бактерии никуда не спешат и будут спокойно дожидаться появления новых исследовательских методик и приборов.

Источник: Zachary D. Blount, Jeffrey E. Barrick, Carla J. Davidson, Richard E. Lenski. Genomic analysis of a key innovation in an experimental Escherichia coli population // Nature. Published online 19 September 2012.