Рис. 1. Схема сигнального каскада, запускающего программу «брачного поведения» у дрожжей. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Большинство белковых молекул состоит из нескольких функциональных блоков (доменов). На примере сигнального каскада, управляющего половым поведением дрожжей, американские биологи показали, что перекомбинирование блоков является эффективным способом создания новых признаков. В частности, удалось получить дрожжи, у которых эффективность брачного поведения (вероятность спаривания) выросла втрое по сравнению с «диким типом». Исследование показало, что перетасовка белковых доменов может быть важным механизмом появления эволюционных новшеств наряду с дупликацией генов и изменениями регуляторных участков ДНК.

Многие белки, участвующие в передаче сигналов, содержат домены двух типов — регуляторные и каталитические. Первые реагируют на поступающие сигналы и определяют условия, при которых белок-передатчик «сработает». Вторые передают сигнал следующему участнику каскада (например, присоединяют фосфатную группу к другому белку, переводя его в активное состояние). Каждый такой белок действует как оператор условного перехода «если... то», причем регуляторный домен отвечает за «если», а каталитический — за «то».

Ученые давно предполагали, что рекомбинация (перетасовка) фрагментов белковых молекул может быть важным источником эволюционных новшеств (см. В. А. Ратнер, 1993. Внешние и внутренние факторы и ограничения молекулярной эволюции). Молекулярные биологи из Калифорнийского университета в Сан-Франциско экспериментально подтвердили это предположение на примере хорошо изученного сигнального каскада, регулирующего половое поведение у дрожжей.

Дрожжи делятся на два «пола»: а и б. Эксперименты проводились с полом а. Сигналом к спариванию для этих клеток служит альфа-фактор — феромон, выделяемый полом б (рис. 1). Феромон взаимодействует с рецептором Ste2, который находится на поверхности клетки а. В результате комплекс из трех белков, прикрепленный к рецептору с внутренней стороны мембраны, распадается. Освободившийся белок Ste4 взаимодействует с белком Ste5, в результате чего Ste5 с прикрепленными к нему MAP-киназами Ste11, Ste7 и Fus3 транспортируется к клеточной мембране. Здесь благодаря посредничеству белка Ste50 устанавливается связь между Ste11 и Cdc42. Последний белок входит в состав комплекса из трех белков, один из которых — киназа Ste20 — активирует белок Ste11, прикрепляя к нему фосфатную группу. Ste11, в свою очередь, фосфорилирует киназу Ste7, а она тем же способом активирует киназу Fus3. Активированный белок Fus3 отправляется в ядро, где он активирует ряд транскрипционных факторов (белков, регулирующих активность генов). Эти транскрипционные факторы включают комплекс генов, необходимых для спаривания. В клетке приостанавливаются процессы, связанные с ростом и делением, меняется морфология клетки, и кончается всё тем, что клетка а сливается со своим половым партнером — клеткой б.

Эксперименты проводились с 11 белками, которые на рис. 1 обозначены серыми овалами. Шесть из них состоят из двух или более доменов. Каждый многодоменный белок (точнее, ген, его кодирующий) разрезали на две части, как показано на рис. 2. Фрагменты перекомбинировались случайным образом, и в итоге были получены гены 66 новых белков.

Эти гены затем поодиночке вставляли в дрожжевые клетки. При этом «дикий» сигнальный каскад оставляли без изменений, лишь добавляя к нему новых потенциальных участников. Все искусственные гены были соединены с одним и тем же регуляторным участком (промотором), что обеспечивало одинаковый (не очень высокий) уровень активности внедренных генов.

После этого исследователи изучили эффективность работы сигнального каскада у 66 генно-модифицированных штаммов дрожжей. Для этого в их геномы был добавлен ген зеленого флуоресцирующего белка, соединенный с промотором, который реагирует на один из транскрипционных факторов, активируемых белком Fus3. В результате по силе свечения можно было определить силу реакции сигнального каскада на добавление в среду альфа-фактора. Регистрировались два параметра: «базовая» сила свечения, которая наблюдается еще до добавления альфа-фактора, и скорость, с которой свечение усиливается после добавления феромона.

Оказалось, что в 10 случаях из 66 добавление нового белка существенно изменило поведение сигнального каскада. У одних штаммов изменился базовый уровень активности, у других — интенсивность реакции на феромон.

Рис. 2. Перекомбинирование доменов белков — участников сигнального каскада. Слева — доменная структура 11 белков, использовавшихся в эксперименте. Зеленым цветом обозначены регуляторные домены, оранжевым — каталитические. Справа показано, каким образом белки были разделены на части. Красные линии соответствуют 66 новым многодоменным белкам. Рисунок из обсуждаемой статьи в Science

Но эти изменения теоретически могли быть вызваны не перекомбинированием доменов в добавленном белке, а просто тем обстоятельством, что какого-то функционального домена в клетке стало больше. Чтобы исключить эту возможность, был проведен ряд контрольных экспериментов. В клетки вставляли дополнительные копии целых генов, их усеченных, но работающих вариантов (кодирующих только один из двух фрагментов многодоменного белка) и различные комбинации таких усеченных генов. Все эти манипуляции, однако, не привели к существенным изменениям работы сигнального каскада. Таким образом, полученные в эксперименте новые фенотипические признаки связаны именно с новыми свойствами белков, образованных путем перекомбинирования доменов.

Приводит ли более интенсивная работа сигнального каскада у модифицированных дрожжей к реальному повышению половой активности? Чтобы это выяснить, авторы смешивали модифицированные клетки с «дикими» дрожжами другого пола (альфа) и подсчитывали число успешных слияний. Оказалось, что те модифицированные дрожжи, у которых скорость реагирования каскада на феромон увеличилась, действительно спариваются значительно чаще, чем контрольные, и наоборот — те клетки, у которых чувствительность каскада снизилась, спариваются реже, чем положено.

Рекордсменами оказались дрожжи с искусственным белком, состоящим из «левой» (N) части Ste50 и «правой» (C) части Ste7, а также те, которым внедрили химерный белок из левой половины Ste5 и правой половины Ste11. Эти «половые гиганты» спаривались с дрожжами пола альфа втрое чаще, чем контрольные дикие дрожжи пола а.

Для некоторых случаев удалось расшифровать молекулярные механизмы возникших фенотипических изменений (рис. 3).

Рис. 3. Два механизма влияния искусственных белков на работу сигнального каскада. Рисунок из дополнительных материалов к обсуждаемой статье в Science

Слева на рисунке 3 показана ситуация, ведущая к повышению половой активности дрожжей. Добавленный белок состоит из регуляторного домена белка Ste5 (желтый) и каталитического домена белка Ste11 (малиновый). Присутствие этого белка создает дополнительный «обходной» путь передачи сигнала. Своим регуляторным доменом новый белок присоединяется к Ste4, который перед этим был активирован вследствие присоединения альфа-фактора к рецептору Ste2. В результате каталитический домен нового белка активируется белком Ste20 и сам, в свою очередь, активирует белок Ste7. Наличие этого обходного пути заставляет клетку интенсивнее реагировать на феромон, что повышает вероятность спаривания.

Справа показана ситуация, когда эффективность полового поведения снижается, хотя базовый уровень активности сигнального каскада растет. Иными словами, каскад начинает «фонить»: он почти перестает реагировать на альфа-фактор, вместо этого посылая в ядро бессмысленный сигнал, генерируемый внутри самого каскада независимо от наличия феромона. В этом случае новый белок состоит из регуляторного домена Ste50 и каталитического домена Ste20. Регуляторный домен химерного белка присоединяется, как ему и положено, к Ste11. В результате каталитический домен химерного белка оказывается рядом со Ste11 и активирует его. Таким образом, сигнал генерируется самопроизвольно, без участия двух белковых комплексов, расположенных на мембране.

Может ли повышение половой активности дрожжей, наблюдавшееся в эксперименте, быть адаптивным? Будет ли оно поддержано отбором, если такая мутация возникнет в природной популяции? Это вполне возможно, но для точного ответа понадобятся дополнительные исследования. А пока авторы смогли только продемонстрировать, что повышение половой активности не приводит к существенному замедлению роста клеток и ослаблению реакции на изменения осмотического давления (два побочных эффекта, которые теоретически могли бы наблюдаться в данном случае).

Исследование показало, что перекомбинирование доменов действительно может быть важным источником эволюционных новшеств — наряду с другими «крупномасштабными» мутациями, такими как дупликация генов (см.: Многофункциональные гены — основа для эволюционных новшеств, «Элементы», 30.06.2008) и перекомбинирование или появление новых регуляторных участков ДНК, что ведет к изменению структуры связей в генно-регуляторных сетях (см. «Тонкая подстройка» многофункционального гена может приводить к появлению новых признаков, «Элементы», 25.04.2006).

Авторы подчеркивают, что перекомбинирование доменов может приводить к мгновенному появлению новых признаков, тогда как дупликация генов, как правило, создает новшества не сразу, а лишь после того, как две копии гена хоть немного «разойдутся» по своим функциям, накопив нуклеотидные замены. Это видно, в частности, из того, что в одном из контрольных опытов имитировалась генная дупликация — в геном дрожжей вставляли дополнительные копии генов, и это не приводило к существенным фенотипическим изменениям. Перекомбинирование доменов, напротив, позволило получить большое разнообразие фенотипов, в том числе вывести дрожжи с утроенной половой активностью.

Источник: Sergio G. Peisajovich, Joan E. Garbarino, Ping Wei, Wendell A. Lim. Rapid Diversification of Cell Signaling Phenotypes by Modular Domain Recombination // Science. 2010. V. 328. P. 368–372.

См. также о механизмах появления эволюционных новшеств:

1) За счет точечных мутаций в кодирующих областях генов:

• Пути эволюции предопределены на молекулярном уровне, «Элементы», 12.04.2006.
• Чтобы дикий рис превратился в культурный, хватило единственной мутации, «Элементы», 07.04.2006.
• Эволюция защитной окраски у мышей изучена на молекулярном уровне, «Элементы», 02.09.2009.

2) За счет изменений регуляторных последовательностей:

• «Тонкая подстройка» многофункционального гена может приводить к появлению новых признаков, «Элементы», 25.04.2006.
• Генетические механизмы формирования сложных признаков постепенно проясняются, «Элементы», 14.04.2010.
• Способность к сложному коллективному поведению может возникнуть благодаря единственной мутации, «Элементы», 25.05.2006.

3) За счет дупликации генов:

• Многофункциональные гены — основа для эволюционных новшеств, «Элементы», 30.06.2008.
• Удвоение генов может приводить к видообразованию, «Элементы», 04.02.2009.
• Прослежена эволюционная история одного из человеческих генов, «Элементы». 17.06.2008.

Александр Марков