Рибопереключатели — новая мишень для антибиотиков

Рис. 1. Принцип поиска соединений, блокирующих синтез рибофлавина в бактериях. а — в присутствии ингибитора рибофлавин восстанавливает рост бактерий. b — и флавинмононуклеотид (FMN), и рибоцил блокируют функцию мРНК гена, участвующего в синтезе рибофлавина. Они связываются с рибопереключателем — регуляторным доменом в некодирующей области мРНК и блокируют ее трансляцию в белок. с — структуры флавинмононуклеотида и рибоцила сильно различаются. Рисунок из синопсиса к обсуждаемой статье в Nature

Скрининг почти 57 000 токсичных для бактерий синтетических соединений позволил выявить высокоспецифический регулятор трансляции мРНК одного из генов пути синтеза рибофлавина, жизненно важного для батерий. Несмотря на отличие структуры этого регулятора (его назвали рибоцилом) от структуры естественного регулятора флавинмононуклеотида, рибоцил тоже оказался способным блокировать этот путь, выключая рибопереключатель гена ribB и подавляя таким образом трансляцию мРНК. Рибопереключатели могут стать перспективными мишенями для разработки новых синтетических лекарственных средств.

Открытие и успешное применение антибиотиков для лечения инфекционных заболеваний можно считать величайшим достижением медицины ХХ века. Открыватели антибиотиков были удостоены Нобелевских премий: в 1939 году премию присудили Герхарду Домагку за открытие антибактериального эффекта пронтозила (см. Prontosil), а в 1945 году премия досталась Александру Флемингу, впервые выделившему пенициллин, и Ховарду Флори с Эрнстом Чейном, получившим его в чистом виде. Термин «антибиотики» был предложен в 1942 году Зельманом Ваксманом, который был награжден Нобелевской премией за открытие стрептомицина (в 1952 году). Традиционно антибиотиками называли природные антибактериальные или антигрибковые агенты. В последнее время это название распространяют и на искусственно синтезированные соединения, которые в ряде случаев даже более активны, чем природные.

Открытие антибиотиков оказалось одним из главных прорывов в медицине ХХ века и позволило справиться с большим числом ранее неизлечимых болезней. Но некоторое время назад стало ясно, что массовое применение антибиотиков служит сильным драйвером естественного отбора для многих патогенных бактерий, в результате чего они рано или поздно могут вырабатывать механизмы резистентности (устойчивости) к антибиотикам (см. также статьи А. Чубенко «Антибиотиковый апокалипсис» и Д. Гилярова «Конец прекрасной эпохи»). Можно выделить следующие основные пути приобретения резистентности:

• приобретение бактерией ферментов, разрушающих или модифицирующих антибиотик (например, в результате приобретения генов таких ферментов от других бактерий при помощи горизонтального переноса генов);
• перестройка структуры рибосом, в результате которой они перестают связываться с антибиотиком, блокирующим трансляцию;
• мутации мишеней антибиотиков — белков, участвующих в биогенезе клеточной стенки бактерий;
• генетические мутации бактерий, меняющие их метаболизм так, что пути метаболизма, блокируемые антибиотиком, перестают быть необходимыми;
• перестройки клеточной стенки бактерии или механизмов транспорта через нее, в результате которых антибиотик либо не проникает в клетку, либо быстро выводится.

Из сказанного ясно, что медицинская практика постоянно требует новые антибиотики. Однако многие фармацевтические компании отказываются от таких разработок, считая их нерентабельными.

Рис. 2. Структурная формула рибофлавина. Рисунок с сайта en.wikipedia.org

Исследователи корпорации Merck не последовали этой тенденции. Они сосредоточились на поиске соединений, подавляющих рост бактерий за счет блокировки у них пути синтеза рибофлавина (витамина В₂). Рибофлавин (рис. 2) является предшественником флавинмононуклеотида (ФМН) и флавинадениндинуклеотида — коферментов (небелковых компонентов) ряда окислительно-восстановительных ферментов, жизненно важных для всех организмов. Многие бактерии, растения и грибы могут синтезировать рибофлавин. Если рибофлавина в среде достаточно, срабатывает регуляторный механизм по принципу отрицательной обратной связи, и его синтез прекращается. (Позвоночные, в том числе человек, синтезировать рибофлавин не могут, а получают его с пищей. Человеку рибофлавин и его производные необходимы для продукции антител, образования эритроцитов и осуществления функции гемоглобина, многих других функций органов и организма.)

Поиски блокаторов путей синтеза рибофлавина проводились на модельном объекте — кишечной палочке. Эти пути одинаковы для многих микроорганизмов, в том числе болезнетворных. Нужные вещества искали среди синтетических низкомолекулярных ингибиторов роста бактерий: ученых интересовали те из них, которые блокируют у бактерий синтез рибофлавина. То есть эти ингибиторы должны были подавлять рост бактерий в отсутствие в среде рибофлавина, но позволять рост при наличии рибофлавина (рис. 1). На кишечной палочке было проверено примерно 57 000 (!) соединений и найдено то, которое отвечало нужным требованиям. Это вещество назвали рибоцилом (ribocil). При испытании in vivo на мышах рибоцил примерно в 1000 раз тормозил размножение патогенных бактерий.

В поисках мишени действия рибоцила ученые выращивали бактерии в присутствии сублетальных концентраций этого соединения, чтобы вывести устойчивые клоны. Когда бактерии переставали погибать от рибоцила (что означало, что они приспособились и выработали мутации устойчивости к рибоцилу), геномы полученного клона полностью секвенировали и сравнивали с геномом исходной кишечной палочки. Таким образом ученые определяли, в каких местах произошли мутации.

Оказалось, что мутации, вызывающие устойчивость к рибоцилу, локализованы в так называемом рибопереключателе гена ribB (рис. 3), кодирующего фермент DHBP-синтазу (см. DHBP synthase), ответственный за синтез одного из предшественников рибофлавина. Рибопереключатель представляет собой нуклеотидную последовательность, расположенную в 5′-нетранслируемой области мРНК перед последовательностью, кодирующей белок; он характеризуется выраженной вторичной структурой и служит для регуляции трансляции (о рибопереключателях, или РНК-переключателях, см. Сложные РНК-переключатели — новый механизм регуляции генов, «Элементы», 18.10.2006). Когда ФМН находится в среде в достаточном количестве, он образует с рибопереключателем конформацию, препятствующую трансляции мРНК. При дефиците ФМН трансляция мРНК возобновляется. Несмотря на то что структура молекулы рибоцила сильно отличается от ФМН, рибоцил тоже образует комплекс с рибопереключателем гена ribB и блокирует трансляцию мРНК. Это было подтверждено данными рентгеноструктурного анализа.

Рис. 3. Структура рибопереключателя гена ribB и локализация мутаций устойчивости к рибоцилу. а — cхема функционирования рибопереключателя гена ribB. Слева — флавинмононуклеотид (ФМН) связывается с аптамером рибопереключателя и вызывает изменение конформации платформы экспрессии, блокирующее трансляцию. Справа — в отсутствие ФМН конформация аптамера позволяет трансляцию. b — рассчитанная вторичная структура рибопереключателя гена ribB. Зелеными квадратами отмечены точки контакта с ФМН. Розовым цветом обозначены мутации устойчивости к рибоцилу. Рисунок из обсуждаемой статьи в Nature

Таким образом, авторы впервые идентифицировали синтетическую молекулу, способную «выключать» рибопереключатель несмотря на то, что она сильно отличается от природного эффектора. Это отличие снижает возможность проявления каких-то нежелательных побочных биологических эффектов. И действительно, даже очень высокие концентрации рибоцила оказались нетоксичными для мышей. В общем, авторы показали, что некодирующие рибопереключатели могут стать перспективными мишенями для разработки новых синтетических лекарственных средств. Если предложенный подход найдет практическое применение, то можно надеяться, что болезнетворные микроорганизмы достаточно долго не смогут выработать резистентность к новым антибиотикам.

Источники:
1) John A. Howe et al. Selective small-molecule inhibition of an RNA structural element // Nature. 2015. V. 526. P. 672–677.
2) Thomas Hermann. Non-coding RNA: Antibiotic tricks a switch // Nature. 2015. V. 526. P. 650–651. (Синопсис к обсуждаемой статье.)

Вячеслав Калинин